Раскручивается: Недопустимое название — Викисловарь

Times, Sunday Times (2017)

Times, Sunday Times (2009)

Times, Sunday Times (2014)

Times, Sunday Times (2006)

Times, Sunday Times (2015)

The Sun (2012)

Times, Sunday Times (2014)

Times, Sunday Times (2009)

Times, Sunday Times (2008)

Times, Sunday Times (2008)

Подробнее …

Солнце (2014)

Times, Sunday Times (2010)

Солнце (2011)

Солнце (2012)

Times, Sunday Times (2013)

Times, Sunday Times (2013)

Солнце (2016)

Times, Sunday Times (2007)

Солнце (2009)

Times, Sunday Times (2009)

Times, Sunday Times (2007)

Солнце (2016)

Unwind Definition

Что такое раскрутка позиции?

Раскручивать — значит закрывать торговую позицию, и этот термин обычно используется, когда сделка сложная или крупная. Раскрутка также относится к исправлению торговой ошибки, поскольку исправление торговой ошибки может быть сложным или требовать нескольких шагов или сделок.Например, брокер по ошибке продает часть позиции, когда инвестор хотел добавить к ней. Брокер должен будет отменить сделку, сначала купив проданные акции, а затем купив те акции, которые должны были быть куплены в первую очередь.

Ключевые выводы

• Раскрутить позицию — значит закрыть ее.
• Как правило, крупные и сложные сделки являются кандидатами на закрытие позиции.
• В некоторых случаях стратегия раскрутки также используется для исправления торговых ошибок.

Как работает размотка

Раскрутка используется для обозначения закрытия сделок, которые требуют нескольких шагов, сделок или времени. Если инвестор занимает длинную позицию по акциям и в то же время продает путы по той же самой проблеме, ему в какой-то момент нужно будет свернуть эти сделки. Это влечет за собой покрытие опционов и продажу базовых акций. Подобный процесс будет сопровождаться брокером, пытающимся исправить ошибку покупки или продажи.

Раскрутка — это процесс отмены или закрытия сделки путем участия в компенсирующей транзакции.

Закрытие позиции

Закрытие позиции — это процесс, необходимый для исключения конкретной инвестиции из портфеля. В случае с ценными бумагами, когда инвестор хочет закрыть позицию, наиболее распространенным действием является продажа ценной бумаги. В случае коротких позиций инвестору необходимо будет выкупить короткие акции, чтобы закрыть позицию. Термин «раскрутка» чаще используется, когда покупка или продажа происходит по нескольким транзакциям, а не только по одной. Раскрутка — это процесс.

Раскрутка для исправления торговых ошибок

Если брокер случайно выполняет неправильное действие со средствами инвестора, например, покупает больше определенной ценной бумаги, когда было приказано ее продать, брокер должен перепродать случайно купленную ценную бумагу, чтобы исправить ошибку. Затем они должны совершить первоначальную запрошенную продажу. Если брокер терпит убытки в процессе исправления ошибок, ответственность за разницу несет брокер, а не инвестор.

Другие действия, которые можно считать торговой ошибкой, включают покупку или продажу ценной бумаги, отличной от указанной, покупку или продажу неправильного количества ценной бумаги или торговлю запрещенными ценными бумагами. Ошибки, которые обнаруживаются до полной обработки и успешно отменяются, не требуют удаления.

Раскрутка и риск ликвидности

Риск ликвидности может отрицательно сказаться на способности инвестора или брокера отменить транзакцию.Ликвидность означает легкость, с которой можно купить или продать конкретный актив. Если актив менее ликвиден, сложнее найти подходящего покупателя или продавца, поэтому риск ликвидности повышается. Независимо от того, была ли транзакция завершена намеренно или случайно, все риски, связанные с конкретной ценностью, по-прежнему применяются при попытке ее открутить.

Unwind (1) (Unwind Dystology): 9781416

1 · Коннор

Коннор не уверен, но, глядя в глаза Ариане, его сомнения развеиваются, хотя бы на мгновение. Ее глаза сладко-фиолетовые с серыми прожилками. Она такая рабыня моды — всегда получает новейшие инъекции пигмента, как только они становятся модными. Коннору это никогда не нравилось. Его глаза всегда были того же цвета, что и они. Коричневые. У него даже не было татуировок, как это делают многие дети в наши дни, когда они маленькие. Единственный цвет его кожи — это загар, который он принимает летом, но теперь, в ноябре, этот загар уже давно поблек.Он старается не думать о том, что никогда больше не увидит лета. По крайней мере, не как Коннор Ласситер. Он до сих пор не может поверить, что его жизнь украли в шестнадцать лет.

Фиолетовые глаза Арианы начинают светиться, когда они наполняются слезами, которые текут по ее щекам, когда она моргает. «Коннор, мне очень жаль». Она держит его, и на мгновение кажется, что все в порядке, будто они единственные два человека на Земле. В этот момент Коннор чувствует себя непобедимым, неприкосновенным… но она отпускает, момент проходит, и мир вокруг него возвращается.Он снова может чувствовать грохот автострады под ними, когда проезжают машины, не зная и не заботясь о том, что он здесь. И снова он просто замечательный ребенок, которому не хватает недели, чтобы расслабиться.

Мягкие, обнадеживающие слова, которые говорит ему Ариана, сейчас не помогают. Он едва слышит ее из-за оживленного движения. Это место, где они прячутся от мира, является одним из тех опасных мест, которые заставляют взрослых качать головой, благодарные за то, что их собственные дети не настолько глупы, чтобы болтаться на выступе эстакады автострады.Для Коннора дело не в глупости или даже бунте, а в чувстве жизни. Сидя на этом выступе, спрятанном за знаком выхода, он чувствует себя наиболее комфортно. Конечно, один неверный шаг — и он погибнет. Но для Коннора жизнь на грани — это дом.

Других девушек, которых он приводил сюда, не было, хотя он не сказал об этом Ариане. Он закрывает глаза, чувствуя вибрацию машин, словно они пульсируют по его венам, как часть его самого. Это всегда было хорошим местом, чтобы убежать от ссор с родителями или когда он просто чувствует себя разбитым.Но теперь Коннор не в себе — даже за пределами борьбы с его мамой и папой. Больше не из-за чего драться. Его родители подписали приказ — дело сделано.

«Мы должны бежать», — говорит Ариана. «Мне тоже все надоело. Моя семья, школа, все. Я мог уйти в самоволку и никогда не оглядываться ».

Коннор цепляется за мысль. Мысль о том, чтобы самому пнуть самоволку, пугает его. Он мог бы вести жесткий фронт, вести себя как плохой мальчик в школе — но убегать сам? Он даже не знает, хватит ли ему смелости.Но если придет Ариана, все по-другому. Не только это. «Вы имеете в виду это?»

Ариана смотрит на него своими волшебными глазами. «Конечно. Конечно. Я мог бы уйти отсюда. Если бы вы спросили меня.

Коннор знает, что это серьезная проблема. Убегая с Unwind — , это обязательство . Тот факт, что она это сделает, не может передать словами. Он целует ее, и, несмотря на все происходящее в его жизни, Коннор внезапно чувствует себя самым удачливым парнем в мире. Он держит ее — может быть, слишком крепко, потому что она начинает извиваться.Ему просто хочется обнять ее еще крепче, но он борется с этим побуждением и отпускает. Она улыбается ему.

«Самоволка…» — говорит она. «Что это вообще значит?»

«Это старый военный термин или что-то в этом роде», — говорит Коннор. «Это означает» без разрешения «?»

Ариана думает об этом и усмехается. «Хм. Скорее «живы без лекций»? »

Коннор берет ее руку, изо всех сил стараясь не сжимать ее слишком сильно. Она сказала, что пойдет, если он ее попросит. Только сейчас он понимает, что на самом деле еще не спросил.

«Ты пойдешь со мной, Ариана?»

Ариана улыбается и кивает. «Конечно», — говорит она. «Конечно я буду.»

Родители Арианы не любят Коннора. «Мы всегда знали, что он будет Расслабляющимся», — он слышит их слова. «Тебе следовало держаться подальше от этого мальчика Ласситера». Для них он никогда не был «Коннором». Он всегда был «этим мальчиком Ласситером». Они думают, что только потому, что он учился и окончил дисциплинарную школу, они имеют право судить его.

Тем не менее, когда он идет к ней домой в тот день, он останавливается перед ее дверью, прячась за деревом, когда она входит внутрь.Перед тем как отправиться домой, он думает о том, как скрываться теперь станет образом жизни для них обоих.

Дом.

Коннор задается вопросом, как он может называть место, где он живет, домом, когда его собираются выселить — не только из того места, где он спит, но и из сердец тех, кто должен его любить.

Его отец сидит в кресле и смотрит новости, когда входит Коннор.

«Привет, папа».

Его отец указывает на случайную бойню в новостях. «Снова клапперы».

«Во что они попали на этот раз?»

«Они взорвали старый флот в торговом центре Северного Акрона.

«Хм, — говорит Коннор. «Можно подумать, у них вкус получше».

«Мне это не смешно».

Родители Коннора не знают, что Коннор знает, что его раскручивают. Он не должен был это выяснять, но Коннор всегда умел разгадывать секреты. Три недели назад, ища степлер в домашнем офисе своего отца, он нашел билеты на самолет на Багамы. Они собирались в отпуск с семьей на День Благодарения. Но есть одна проблема: билетов было всего три.Его мать, его отец, его младший брат. Для него нет билета. Сначала он просто подумал, что билет находится где-то в другом месте, но чем больше он думал о нем, тем больше он казался неправильным. Так что Коннор пошел немного глубже, когда его родители отсутствовали, и он нашел это. Порядок Расслабления. Он был подписан в трех старомодных экземплярах. Белая копия уже пропала — у властей. Желтая копия будет сопровождать Коннора до его конца, а розовая останется с его родителями, как свидетельство того, что они сделали.Возможно, они поставят его в рамку и повесят рядом с его первоклассной картиной.

Дата заказа была за день до поездки на Багамы. Он собирался расслабиться, а они собирались в отпуск, чтобы почувствовать себя лучше. Из-за несправедливости этого Коннору захотелось что-то сломать. Это заставило его хотеть сломать много вещей, но он этого не сделал. На этот раз он сдержал себя и, если не считать нескольких драк в школе, которые не были его виной, он скрывал свои эмоции. Он держал то, что знал, при себе.Все знали, что приказ о размотке необратим, поэтому крики и драки ничего не меняли. Кроме того, он обнаружил определенную силу в знании тайны своих родителей. Теперь удары, которые он мог им наносить, были намного эффективнее. Как в тот день, когда он принес домой цветы для своей матери, и она плакала часами. Как и B-plus, он принес домой на научный тест. Лучшая оценка, которую он когда-либо получал по естествознанию. Он протянул его отцу, и тот посмотрел на него, краска сошла с его лица. «Смотри, папа, мои оценки улучшаются.К концу семестра я могу даже довести свою научную оценку до пятерки «. Час спустя его отец сидел в кресле, все еще сжимая тест в руке и тупо глядя в стену.

Мотивация Коннора была проста: заставить их страдать. Дайте им знать на всю оставшуюся жизнь, какую ужасную ошибку они совершили.

Но в этой мести не было сладости, и теперь, после трех недель втирания ею в лицо, он не почувствовал себя лучше. Несмотря на себя, он начинает чувствовать себя плохо из-за своих родителей, и он ненавидит то, что он так думает.

«Я пропустил ужин?»

Его отец не отводит взгляда от телевизора. «Твоя мама оставила тебе тарелку».

Коннор направляется к кухне, но на полпути слышит:

«Коннор?»

Он поворачивается и видит, что на него смотрит отец. Не просто смотрел, а смотрел. Он сейчас мне расскажет, думает Коннор. Он собирается сказать мне, что они меня раскручивают, а затем разрыдется, продолжая и продолжая говорить о том, как ему жаль, что он сожалеет обо всем этом. Если он это сделает, Коннор просто может принять извинения. Он может даже простить его, а затем сказать, что не планирует быть здесь, когда полицейские Джувей приедут, чтобы забрать его. Но, в конце концов, его отец говорит только одно: «Ты запер дверь, когда вошел?»

«Я сделаю это сейчас».

Коннор запирает дверь, затем идет в свою комнату, больше не испытывая жажды того, что его мать приберегла для него.

В два часа ночи Коннор одевается в черное и набивает рюкзак вещами, которые для него действительно важны.У него еще есть место для трех смен одежды. Когда дело доходит до него, он находит удивительным, как мало вещей стоит брать. В основном воспоминания. Напоминания о времени до того, как между ним и его родителями все пошло не так, как надо. Между ним и остальным миром.

Коннор смотрит на своего брата, думает разбудить его, чтобы попрощаться, но решает, что это плохая идея. Он тихо ускользает в ночь. Он не может взять свой велосипед, потому что на нем установлено противоугонное устройство слежения. Коннор никогда не думал, что это он мог украсть его.Хотя у Арианы есть велосипеды для них обоих.

Дом Арианы находится в двадцати минутах ходьбы по обычному маршруту. В пригородах Огайо никогда не бывает улиц, идущих по прямой линии, поэтому вместо этого он выбирает более прямой маршрут, через лес, и добирается до него за десять.

Свет в доме Арианы выключен. Он ожидал этого. Было бы подозрительно, если бы она не спала всю ночь. Лучше притвориться спящей, чтобы не заподозрить никаких подозрений. Он держится подальше от дома.Двор и крыльцо Арианы оборудованы датчиками движения, которые загораются всякий раз, когда что-либо попадает в зону досягаемости. Они предназначены для отпугивания диких животных и преступников. Родители Арианы убеждены, что Коннор и то и другое.

Он достает телефон и набирает знакомый номер. Оттуда, где он стоит в тени на краю заднего двора, он слышит, как он звонит в ее комнате наверху. Коннор быстро отключается и снова ныряет в тень, опасаясь, что родители Арианы могут выглядывать из своих окон.Что она думает? Ариана должна была оставить свой телефон включенным.

Он делает широкую дугу по краю заднего двора, достаточно широкую, чтобы не включать свет, и хотя свет загорается, когда он ступает на крыльцо, в эту сторону выходит только спальня Арианы. Через несколько мгновений она подходит к двери, приоткрыв ее недостаточно широко, чтобы она могла выйти или он мог войти.

«Привет, ты готов?» — спрашивает Коннор. Ясно, что это не так; она носит халат поверх атласной пижамы.»Вы же не забыли, не так ли?»

«Нет, нет, я не забыл…»

«Так что поторопись! Чем раньше мы выберемся отсюда, тем больше у нас будет зацепки, прежде чем кто-нибудь узнает, что мы ушли ».

«Коннор, — говорит она, — вот в чем дело…»

И правда в ее голосе, в том, как ей так тяжело даже произнести его имя, в воздухе витает дрожь извинений. как эхо. После этого ей не нужно ничего говорить, потому что он знает, но все равно позволяет ей сказать это.Потому что он видит, как ей тяжело, и хочет, чтобы это было. Он хочет, чтобы это было самым трудным делом, которое она когда-либо делала в своей жизни.

«Коннор, я действительно хочу поехать, я хочу… но сейчас для меня очень плохое время. Моя сестра выходит замуж, и вы знаете, что она выбрала меня в качестве подружки невесты. А потом еще школа.

«Ты ненавидишь школу. Ты сказал, что бросишь школу, когда тебе исполнится шестнадцать.

« Тестирование », — говорит она. «Есть разница».

«Так ты не идешь?»

«Я хочу, правда, , правда, хочу… но не могу.

«Значит, все, о чем мы говорили, было ложью».

«Нет, — говорит Ариана. «Это был сон. Реальность помешала, вот и все. А бегство ничего не решает ».

«Убежать — единственный способ спасти мою жизнь», — шипит Коннор. «Меня вот-вот раскрутят, если ты забыл».

Она нежно касается его лица. «Я знаю», — говорит она. «Но не я.»

Затем наверху лестницы загорается свет, и Ариана рефлекторно закрывает дверь на несколько дюймов.

«Ари?» Коннор слышит, как говорит ее мать. «Что это? Что ты делаешь у двери? »

Коннор скрывается из виду, а Ариана поворачивается, чтобы посмотреть на лестницу. «Ничего, мама. Мне показалось, что я увидел койота из окна, и я просто хотел убедиться, что кошки не вышли ».

«Кошки наверху, милый. Закройте дверь и возвращайтесь в постель ».

«Итак, я койот», — говорит Коннор.

«Тише», — говорит Ариана, закрывая дверь до тех пор, пока не остается только крошечная щель, и все, что он может видеть, — это край ее лица и единственный фиолетовый глаз.«Ты уйдешь, я знаю, что ты уйдешь. Позвони мне, когда попадешь в безопасное место. Затем она закрывает дверь.

Коннор стоит там дольше всех, пока не погаснет свет датчика движения. Пребывание в одиночестве не было частью его плана, но он понимает, что это должно было быть. С того момента, как его родители подписали эти бумаги, Коннор был один.

Он не может сесть на поезд; он не может ездить на автобусе. Конечно, у него достаточно денег, но до утра ничего не уходит, а к тому времени они будут искать его во всех очевидных местах.В наши дни расслабления в бегах настолько распространены, что их поисками занимаются целые команды юви-копов. Полиция считает это искусством.

Он знает, что сможет исчезнуть в городе, потому что лиц так много, что никогда не увидеть одно и то же дважды. Он знает, что может также исчезнуть в стране, где людей так мало и далеко друг от друга; он мог бы устроить дом в старом сарае, и никто бы не подумал посмотреть. Но потом, Коннор полагает, что полиция, вероятно, подумала об этом. Наверное, они устроили каждый старый сарай, чтобы он прыгал, как крысоловка, ловя в ловушку таких детей, как он.А может, он просто параноик. Нет, Коннор знает, что его ситуация требует обоснованной осторожности — не только сегодня вечером, но и в течение следующих двух лет. Затем, когда ему исполняется восемнадцать, он оказывается дома свободным. После этого, конечно, его могут бросить в тюрьму, они могут отдать его под суд, но не могут его раскрутить. Уловка — выжить так долго.

Внизу у межштатной автомагистрали есть остановка для отдыха, где дальнобойщики съезжают с дороги на ночь. Сюда идет Коннор. Он полагает, что может проскользнуть в кузове восемнадцатиколесного грузовика, но быстро узнает, что дальнобойщики держат свой груз запертым.Он проклинает себя за то, что недостаточно предусмотрительно подумал об этом. Думать о будущем никогда не было одной из сильных сторон Коннора. Если бы это было так, он, возможно, не попал бы в различные ситуации, которые преследовали его последние несколько лет. Ситуации, за которые ему навешивали ярлыки «беспокойство» и «риск», и, наконец, последний ярлык «расслабься».

Здесь около двадцати припаркованных грузовиков и ярко освещенная закусочная, где едят полдюжины дальнобойщиков. Сейчас 3:30 утра. Судя по всему, у дальнобойщиков есть свои биологические часы.Коннор смотрит и ждет. Затем, примерно без четверти четыре, к стоянке бесшумно въезжает полицейский крейсер. Ни огней, ни сирены. Он медленно кружит вокруг, как акула. Коннор думает, что может спрятаться, пока не видит, что к нему подъезжает вторая полицейская машина. На участке слишком много огней, чтобы Коннор мог спрятаться в тени, и он не может убежать, не будучи замеченным в ярком лунном свете. Патрульная машина объезжает дальний конец стоянки. Через секунду его фары будут на нем, поэтому он катится под грузовиком и молится, чтобы полицейские не заметили его.

Он наблюдает, как колеса патрульной машины медленно проезжают мимо. По другую сторону восемнадцатиколесной машины в обратном направлении проезжает вторая патрульная машина. Может быть, это обычная проверка, думает он. Может, они меня не ищут. Чем больше он думает об этом, тем больше убеждает себя в том, что это так. Они еще не могут знать, что он ушел. Его отец спит как бревно, а мать больше никогда не проверяет Коннора по ночам.

Тем не менее, милицейские машины кружат.

Со своего места под грузовиком Коннор видит, что дверь водителя еще одного восемнадцатиколесного автомобиля открыта. Нет, это не дверь водителя, это дверь в спальню за кабиной. Появляется дальнобойщик, тянется и направляется к туалетам, оставив дверь приоткрытой.

В мгновение ока Коннор принимает решение и выскакивает из своего укрытия, мчась через парковку к грузовику. Когда он бежит, у него из-под ног выскальзывает рыхлый гравий. Он больше не знает, где находятся полицейские машины, но это не имеет значения.Он взял на себя этот курс действий, и он должен довести его до конца. Когда он приближается к двери, он видит, как фары светят по дуге и собираются повернуться к нему. Он открывает дверь спящего грузовика, бросается внутрь и закрывает за собой дверь.

Он сидит на кровати размером не больше раскладушки, переводя дыхание. Каков его следующий шаг? Водитель грузовика вернется. У Коннора есть пять минут, если ему повезет, и одна минута, если нет. Он заглядывает под кровать. Там внизу есть место, где он может спрятаться, но оно заблокировано двумя спортивными сумками, набитыми одеждой.Он мог вытащить их, втиснуть внутрь и вытащить спортивные сумки обратно перед собой. Водитель грузовика никогда бы не узнал, что он там. Но даже прежде, чем он успевает достать первую спортивную сумку, дверь распахивается. Коннор просто стоит, не в силах отреагировать, когда дальнобойщик тянется к его куртке и видит его.

«Ого! Кто ты? Что, черт возьми, ты делаешь в моем грузовике? »

Полицейская машина медленно проезжает мимо него.

«Пожалуйста», — говорит Коннор, его голос внезапно скрипит, как до того, как его голос изменился.«Пожалуйста, никому не говори. Мне нужно выбраться из этого места ». Он залезает в свой рюкзак, возится, и вытаскивает пачку банкнот из бумажника. «Ты хочешь денег? У меня есть деньги. Я отдам тебе все, что у меня есть.

«Мне не нужны твои деньги», — говорит дальнобойщик.

«Хорошо, а что?»

Даже в тусклом свете дальнобойщик должен видеть панику в глазах Коннора, но он ничего не говорит.

«Пожалуйста, — снова говорит Коннор. «Я сделаю все, что ты хочешь…»

Водитель грузовика еще мгновение смотрит на него в тишине.»Это так?» — наконец говорит он. Затем он заходит внутрь и закрывает за собой дверь.

Коннор закрывает глаза, не смея думать, во что он только что ввязался.

Водитель грузовика сидит рядом с ним. «Как твое имя?»

«Коннор». Затем он слишком поздно понимает, что ему следовало назвать вымышленное имя.

Водитель грузовика почесывает щетину в бороде и на мгновение думает. «Позвольте мне показать вам кое-что, Коннор». Он протягивает руку Коннору и берет колоду карт из мешочка, висящего рядом с кроватью.»Вы когда-нибудь видели это?» Водитель берет колоду карт в одну руку и умело тасует ее одной рукой. «Довольно хорошо, да?»

Коннор, не зная, что сказать, просто кивает.

«Как насчет этого?» Затем дальнобойщик берет одну карту и ловкостью рук заставляет карту раствориться в воздухе. Затем он протягивает руку и вытаскивает карточку прямо из кармана рубашки Коннора. «Тебе нравится это?»

Коннор нервно смеется.

«Ну, эти фокусы, которые вы только что видели?» Водитель грузовика говорит: «Я их не делал.

«Я … не понимаю, о чем ты».

Водитель грузовика закатывает рукав и обнаруживает, что рука, выполнявшая трюки, была наложена на локоть.

«Десять лет назад я заснул за рулем», — рассказывает ему дальнобойщик. «Большая авария. Я потерял руку, почку и еще несколько вещей. Но у меня появились новые, и я справился ». Он смотрит на свои руки, и теперь Коннор видит, что рука с уловками немного отличается от другой. На другой руке дальнобойщика пальцы толще, а кожа чуть более оливкового оттенка.

«Итак, — говорит Коннор, — вы получили новую руку».

Водитель грузовика смеется над этим, затем на мгновение замолкает, глядя на свою замененную руку. «Эти пальцы здесь знали то, чего не знала остальная часть меня. Они называют это мышечной памятью. И не проходит и дня, чтобы я не задавался вопросом, какие еще невероятные вещи знал этот ребенок, который владел этой рукой, до того, как его раскрутили… кем бы он ни был ».

Водитель грузовика встает. «Тебе повезло, что ты пришел ко мне», — говорит он. «Есть дальнобойщики, которые возьмут все, что вы предложите, а потом все равно сдадут.

«А ты не такой?»

«Нет, не помню». Он протягивает руку — свою другую руку — и Коннор пожимает ее. «Джозиас Олдридж», — говорит он. «Я направляюсь на север отсюда. Ты можешь ехать со мной до утра ».

Коннор испытывает такое сильное облегчение, что у него уносит ветер. Он даже не может сказать спасибо.

«Эта кровать не самая удобная в мире, — говорит Олдридж, — но она справляется со своей задачей. Отдохни. Я просто пойду на помойку, а потом мы поедем.Затем он закрывает дверь, и Коннор слушает его шаги, направляясь в ванную. Коннор наконец теряет бдительность и начинает чувствовать собственное истощение. Водитель грузовика не указал ему пункт назначения, только направление, и это нормально. Север, юг, восток, запад — неважно, пока он находится подальше отсюда. Что касается его следующего хода, ну, сначала ему нужно пройти через это, прежде чем он сможет думать о том, что будет дальше.

Минутой позже Коннор уже начинает дремать, когда слышит крик снаружи.

«Мы знаем, что вы там! Выходи сейчас же, и ты не пострадаешь! »

Сердце Коннора замирает. Джозиас Олдридж явно прибегнул к еще одной ловкости рук. Он заставил Коннора явиться в полицию. Абракадабра. Его путешествие закончилось еще до того, как оно началось, Коннор распахивает дверь и видит трех полицейских Джувей, прицеливающих оружие.

Но они не целятся в него.

На самом деле, они спиной к нему.

Напротив, дверь кабины распахивается у грузовика, под которым он прятался всего несколько минут назад, и из-за пустого водительского сиденья выходит ребенок, подняв руки вверх.Коннор сразу узнает его. Это ребенок, которого он знает по школе. Энди Джеймсон.

Боже мой, Энди тоже раскручивают?

На лице Энди выражение страха, но за его пределами — кое-что похуже. Взгляд полного поражения. Вот тогда Коннор осознает свою глупость. Он был так удивлен таким поворотом событий, что до сих пор стоит на виду у всех на виду. Что ж, милиционеры его не видят. Но Энди знает. Он ловит взгляд Коннора, задерживает его взгляд на мгновение…

… и в этот момент происходит нечто замечательное.

Отчаяние на лице Энди внезапно сменяется твердой решимостью, граничащей с триумфом. Он быстро отворачивается от Коннора и делает несколько шагов, прежде чем его схватит полиция — шаги от Коннора на , так что полиция по-прежнему стоит к нему спиной.

Энди видел его и не выдал! Если у Энди больше ничего не останется после этого дня, по крайней мере, он одержит эту маленькую победу.

Коннор откидывается в тень грузовика и медленно закрывает дверь.Снаружи, когда полиция забирает Энди, Коннор снова ложится, и его слезы текут так же внезапно, как летний ливень. Он не знает, по кому он плачет — по Энди, по себе, по Ариане, — и от незнания его слезы текут еще сильнее. Вместо того, чтобы вытирать слезы, он позволяет им высохнуть на лице, как он делал это раньше, когда был маленьким мальчиком, и то, о чем он плакал, было настолько незначительным, что к утру о них забыли.

Водитель грузовика никогда не приезжает проверить его. Вместо этого Коннор слышит запуск двигателя и чувствует, как грузовик выезжает из машины.Нежное движение по дороге убаюкивает его.

Звонок мобильного телефона Коннора пробуждает его от глубокого сна. Он борется с сознанием. Он хочет вернуться к своей мечте. Это было о месте, где он был уверен, хотя не мог точно вспомнить, когда. Он жил в домике на пляже со своими родителями, прежде чем родился его брат. Нога Коннора провалилась сквозь гнилую доску на крыльце в паутину такой толстой, что казалось, будто она вата. Коннор кричал и кричал от боли и страха перед гигантскими пауками, которые, как он был уверен, съели бы его ногу.И все же это был хороший сон — хорошее воспоминание — потому что его отец был там, чтобы вытащить его и отнести внутрь, где они перевязали ему ногу и посадили у огня с каким-то сидром, таким ароматным, что он все еще мог попробуй, когда он подумал об этом. Его отец рассказал ему историю, которую он уже не может вспомнить, но это нормально. Важна была не история, а тон его голоса, мягкий рокот баритона, успокаивающий, как волны, разбивающиеся о берег. Маленький мальчик-Коннор выпил сидр и прислонился к матери, притворяясь, что засыпает, но на самом деле он пытался раствориться в моменте и заставить его длиться вечно.Во сне он действительно растворился. Все его существо перетекло в чашку с сидром, и его родители осторожно поставили ее на стол, достаточно близко к огню, чтобы он всегда и всегда оставался в тепле.

Глупые мечты. Даже хорошие — плохие, потому что напоминают вам, насколько плохо реальность.

Его сотовый телефон звонит снова, прогоняя последний сон. Коннор почти отвечает. В спальной комнате грузовика так темно, что он сначала не понимает, что находится не в своей постели. Единственное, что его спасает, это то, что он не может найти свой телефон и должен включить свет.Когда он находит стену на месте своей прикроватной тумбочки, он понимает, что это не его комната. Телефон снова звонит. Вот тогда все возвращается к нему, и он вспоминает, где находится. Коннор находит свой телефон в рюкзаке. В идентификаторе телефона указано, что звонок от его отца.

Итак, теперь его родители знают, что он ушел. Неужели они думают, что он ответит на звонок? Он ждет, пока голосовая почта принимает вызов, затем выключает питание. Его часы показывают 7:30 утра.Он трет глаза, пытаясь подсчитать, как далеко они зашли.Грузовик больше не движется, но они должны были проехать не менее двухсот миль, пока он спал. Хорошее начало.

Стук в дверь. «Выходи, малыш. Ваша поездка окончена.

Коннор не жалуется — этот водитель грузовика был невероятно великодушен, сделав то, что он сделал. Коннор больше не будет его просить. Он распахивает дверь и выходит поблагодарить человека, но это не Джозиас Олдридж. Олдридж в наручниках в нескольких ярдах от него, а перед Коннором стоит полицейский: Джувей-коп с такой же широкой улыбкой, как на улице.В десяти ярдах от него отец Коннора все еще держит сотовый телефон, с которого только что позвонил.

«Все кончено, сынок, — говорит его отец.

Это приводит Коннора в ярость. Я не твой сын! Он хочет кричать. Я перестал быть твоим сыном, когда ты подписал распоряжение о закрытии! Но шок лишает его дара речи.

Со стороны Коннора было так глупо оставить свой сотовый телефон включенным — именно так они его выследили — и он задается вопросом, сколько других детей попалось в ловушку их слепого доверия к технологиям.Что ж, Коннор пойдет не так, как Энди Джеймсон. Он быстро оценивает ситуацию. Грузовик был остановлен на обочине межштатной автомагистрали двумя патрульными машинами и отрядом «Джувей-коп». Мимо проезжают машины со скоростью семьдесят миль в час, не обращая внимания на маленькую драму, разворачивающуюся на плече. Коннор мгновенно принимает решение и бросается вперед, толкает офицера к грузовику и мчится по оживленному шоссе. Он задается вопросом, выстрелят ли они в спину невооруженному ребенку или выстрелят ему в ноги и пощадят его жизненно важные органы? Когда он мчится на межштатную автомагистраль, машины кружат вокруг него, но он продолжает ехать.

«Коннор, стой!» он слышит крик отца. Затем он слышит выстрелы из пистолета.

Он чувствует удар, но не кожей. Пуля попадает в его рюкзак. Он не смотрит назад. Затем, когда он достигает середины шоссе, он слышит еще один выстрел, и на центральной перегородке появляется небольшое синее пятно. Они стреляют пулями транквилизатора. Они не убивают его, они пытаются убить его — и у них гораздо больше шансов выстрелить по желанию транквилизирующими пулями, чем обычными пулями.

Коннор перелезает через центральную перегородку и оказывается на пути кадиллака, который ни перед чем не останавливается.Автомобиль уклоняется от него, и, по счастливой случайности, импульс Коннора уводит его всего на несколько дюймов с пути Кэдди. Боковое зеркало болезненно бьет его по ребрам, прежде чем машина с визгом останавливается, отчего его ноздри проникает едкая вонь сгоревшей резины. Держа больной бок, Коннор видит, что кто-то смотрит на него из открытого окна заднего сиденья. Это еще один ребенок, одетый во все белое. Малыш в ужасе.

Когда полиция уже подошла к центральной перегородке, Коннор смотрит в глаза этому напуганному ребенку и знает, что ему делать.Пришло время принять еще одно мгновенное решение. Он протягивает руку через окно, поднимает замок и открывает дверь.

раскрутка — Викисловарь

Английский [править]

Этимология [править]

со среднеанглийского unwinden , со староанглийского unwindan («раскручивать; разворачивать»), с протогерманского * andawindaną («раскручивать»); эквивалент ун- + ветер («на катушку»). Познакомьтесь с голландским ontwinden («расслабиться»).

Произношение [править]

Глагол [править]

раскрутка ( простое настоящее в единственном числе от третьего лица раскрутка , причастие настоящего раскручивание , простое причастие прошедшего и прошедшего времени раскручивание )

1. (переходный) Разделить (то, что заведено)

   до размотать клубок пряжи

   Не могли бы вы размотать примерно на фут ленты, чтобы я закончил упаковку?

   Синонимы: раскрутить, раскрутить

2. (переходный, устаревший) Распутать
   • 1836 , Ричард Хукер, Произведения Ричарда Хукера , том 4, страница 27:

     […] но будучи не столь искусными, как в каждом пункте , раскрутите сами, где ловушки лоскутной речи действительно лежат, чтобы запутать их, […]

3. (непереходный, сленг) Чтобы расслабиться; Успокоиться; отдохнуть и снять стресс

   После работы я люблю расслабиться , выкурив трубку и читая газету.

4. (непереходный) Быть или раскручиваться; быть способным раскручиваться или раскручиваться.
5. (переходный, финансовый) Закрыть позицию, особенно сложную.
6. (переходный, финансы) Отменить что-то.
7. (транзитивный, программирование) Для анализа (стека вызовов) с целью создания трассировки стека и т. Д.
   • 2006 , Hans-Wolfgang Loidl, Trends in Functional Programming (volume 5, page 62)

     Если выражение — это бросок, мы раскручиваем стек в поисках выражения обработчика.

Связанные термины [править]

Переводы [править]

Приведенные ниже переводы необходимо проверить и вставить выше в соответствующие таблицы переводов, удалив все цифры. Числа не обязательно совпадают с числами в определениях. См. Инструкции в Викисловаре: макет статьи § Переводы.

Проверяемые переводы

Существительное [править]

разматывает ( во множественном числе разматывает )

1. Любой механизм или операция, которая что-то раскручивает.
   • 1989 , Рут Э. Голденберг, Лоуренс Дж. Кенах, Внутренние компоненты и структуры данных VMS: версия 5, обновление

     Аргумент NEWPC указывает адрес, на который должно быть возвращено управление после завершения раскрутки . Если он не указан, по умолчанию управление возвращается к ПК, сохраненному в кадре вызова, ближайшем к удаленным.

   • 1998 , Tappi Journal (том 81, стр. 207)

     Основная функция разматывающего устройства состоит в том, чтобы направлять полотно в намоточное устройство для продольной резки для точного определения местоположения полотна для разрезания или выравнивания края полотна при прямой перемотке.

Механизм раскручивания ДНК эукариотической репликативной геликазой

Микроскопия

Магнитный пинцет был изготовлен на заказ. Все устройства включались как минимум за несколько часов до начала экспериментов и давали возможность уравновеситься до 23 ° C, чтобы минимизировать вертикальный дрейф в эксперименте.

Светлопольный микроскоп был построен на виброизолированном оптическом столе (Thorlabs, B7590 Nexus Breadboard, PFA51505 Active Isolation Frame), окруженном светонепроницаемой изоляционной камерой для обеспечения стабильности температуры и воздушного потока.Освещение обеспечивалось светодиодом 530 нм (Thorlabs, M530D2) без освещения Келера с использованием только коллимации асферической конденсорной линзой f = 20,1 мм (Thorlabs, ACL2520U-A). Объектив микроскопа Nikon 50 × NA 0.90 (Nikon, MRL01502) в сочетании с ахроматической двойной трубкой 2 ″ f = 200 мм (Thorlabs, AC508-200-A) отображал плоскость образца на камеру Falcon2 12 M ( Teledyne DALSA, FA-80-12M1H) через совместимый с LabVIEW фрейм-граббер (National Instruments, NI PCIe-1433, 781169-01).Камера для образца была установлена ​​на столике перемещения по осям x, y (Märzhäuser, 00-30-101-0000) и закреплена на месте самодельными зажимами для столика. Объектив микроскопа был установлен на пьезоэлементе с осью z (Physik Instrumente, PD72Z1CAQ) для регулировки фокуса.

Магнитный пинцет

Два неодимовых кубических магнита (supermagnete.de, W-05-N50-G) нанесены эпоксидной смолой на покровное стекло микроскопа (Fisher Scientific, 12332098) с магнитными моментами, направленными вертикально в противоположных направлениях с использованием двух алюминиевых прокладок для обеспечения желаемый магнитный зазор.Оставлено оптически прозрачное окно из стекла, позволяющее освещающему свету проходить в камеру для образца. Эта пара магнитов установлена ​​на вертикальном трансляционном столике (Physik Instrumente, M-112.1DG) для изменения силы. Установленная на столике пара магнитов и источник освещения устанавливаются на предметном столике перемещения по осям x, y (Thorlabs, MT1B / M) для совмещения над центром объектива микроскопа.

Fluidics

Выходы предварительно подготовленной камеры для образцов были подключены к шестистороннему селекционному клапану (VWR, 560-0166) через дополнительную трубку (VWR, 554-2962) и иглы без иглы (Hamilton, 21 G, 22021). -01).Шестиходовой клапан подсоединяли к стеклянному шприцу (серия Hamilton 1000, 26211-U) через трехходовой кран (Cole-Parmer, WZ-30600-02). Использование такого шестиходового клапана позволяет легко переключать несколько камер для проб. Шприц извлекали с помощью шприцевого насоса (Harvard Apparatus, 704504).

Программное обеспечение для управления магнитным пинцетом

Управление вертикальным положением (фокусом) объектива и вертикальным положением (силой) магнита выполнялось с помощью специально написанного кода LabVIEW. Для проведения экспериментов использовалась интерактивная программа захвата камеры и отслеживания микросфер.Отличительными особенностями этого программного обеспечения являются отслеживание в реальном времени нескольких положений микросфер с использованием алгоритма, описанного van Loenhout et al. ⁸¹ , а также экспорт отдельных изображений со скоростью до 58 кадров в секунду непосредственно на жесткий диск. Код и программное обеспечение доступны на github.com/danielburnham.

Программное обеспечение для отслеживания микросфер

Отслеживание микросфер для окончательного анализа было выполнено с помощью специально написанного кода MATLAB (Mathworks, 2015a-2017a), основанного на алгоритме, описанном van Loenhout et al. ⁸¹ . Его можно загрузить на github.com/danielburnham

Калибровка силы

Сила, приложенная двумя неодимовыми кубическими магнитами, откалибрована как функция смещения из камеры для образца с использованием метода равнораспределения ²⁷ и скорректирована для конечной экспозиции время ⁸² . Мы использовали два зазора разного размера между парами магнитов, один 0,5 мм и один 1,5 мм, чтобы обеспечить силы низкого и высокого диапазона.

Калибровка удлинения дцДНК в оцДНК

Чтобы преобразовать смещение микросфер, следовательно, удлинение ДНК, z _mes , в количество размотанных пар оснований, мы выполнили измерения силового удлинения раскручивающейся матрицы дцДНК и образца денатурированной оцДНК в CMG. рабочий буфер.Результаты представлены на дополнительном рис. 1b, а значения использованы с

$$ n _ {{\ mathrm {bp}}} = \ frac {{z _ {{\ mathrm {mes}}} (F) — z _ {{ \ mathrm {ds}}} (F)}} {{z _ {{\ mathrm {ss}}} (F) — z _ {{\ mathrm {ds}}} (F)}} N _ {{\ mathrm {tot }}} $$

(3)

для расчета развернутых пар оснований, где z _mes ( F ) — измеренное удлинение ДНК, z _ds ( F ) и z _ss ( F ) — расширения полностью дц- и оцДНК соответственно, а N _tot — длина матрицы в парах оснований.

оцДНК была образована денатурирующей дцДНК. Исходную ДНК (~ 10 нг / мкл) разводили в 5 раз в Milli-Q. Один микролитр этого разбавленного образца дополнительно разбавляли в 10 раз 500 мМ NaOH, нагревали при 37 ° C в течение 10 минут и хранили на льду. Полученная оцДНК используется вместо исходной матричной ДНК при конъюгации ДНК с микросферами.

Камера для образцов

Камера для образцов состоит из трех частей; прокладка, функционализированное покровное стекло и покровное стекло с отверстиями. Все следующие шаги при комнатной температуре, если не указано иное.

Прокладки были вырезаны скальпелем из двусторонних самоклеящихся листов (TESA SE, TESA 4965) до прямоугольников 24 × 40 мм с вырезанными тремя прямоугольниками 3 × 30 мм.

Стеклянные покровные стекла функционализировали, сначала помещая пять покровных стекол размером 24 × 40 × 0,17 мм (Hecht-Assistent, 41014542) в сосуд для окрашивания (Sigma-Aldrich, S5641). Покровные стекла погружали в этанол и обрабатывали ультразвуком в ультразвуковой ванне (Branson, M3800-E, 142-0133) в течение 30 минут, промывали водой Milli-Q (Millipore), затем обрабатывали ультразвуком в 1 M КОН в течение 30 минут и снова промывали. в Milli-Q.Стадии этанола, Milli-Q, KOH, Milli-Q повторяли перед тем, как окончательно оставить погруженным в Milli-Q.

Milli-Q сливали из сосуда, и покровные стекла трижды промывали ацетоном. После каждого полоскания ацетон осторожно сливали на внутреннюю часть крышки банки, чтобы удалить любые следы воды. Во время третьего ополаскивания покровные стекла обрабатывали ультразвуком в течение 10 минут на водяной бане. Наконец, покровные стекла погружали в свежий ацетон.

Затем каждое покровное стекло обрабатывали для постоянного добавления в стекло эталонных микросфер диоксида кремния.Отслеживание положения таких застрявших микросфер описывает движение покровного стекла. Кремнеземные микросферы диаметром три микрометра (Bangs Laboratories, SS05001) разбавляли 1: 100 в этаноле и 4 мкл удлиненной гранулы суспензии помещали вдоль короткого края покровного стекла перед тем, как провести по длинной оси покровного стекла кончиком пипетки. Покровное стекло нагревали на горячей пластине в течение 10 минут при 70 ° C, а затем снова помещали в ацетон в сосуд для окрашивания.

Спешно; 2% (об. / об.) раствор силана получали смешиванием 2 мл 3-аминопропилтриэтоксисилана (Sigma-Aldrich, A3648) в 100 мл ацетона.Ацетон из окрашивающего сосуда декантировали, как описано выше, и сосуд снова наполнили 2% -ным раствором силана. Затем сосуды встряхивали горизонтально во всех направлениях в течение 120 секунд. Затем сосуд быстро наполнялся ~ 2 объемами Milli-Q (без декантации предыдущего раствора). Затем сосуд для окрашивания наполняли, встряхивали и 6 раз декантировали с Milli-Q перед тем, как оставить покровные стекла погруженными в Milli-Q.

Покровные стекла помещали на гофрированную алюминиевую фольгу и помещали в печь при 110 ° C на 1 час.

Бумажная подложка с ранее изготовленных прокладок удаляется и кладется клейкой стороной вверх на стол перед тем, как положить уже сухое покровное стекло силанизированной стороной вниз на прокладку. Слегка надавите, чтобы плотно прижать прокладку к стеклу.

Комбинация покровного стекла и прокладки кладется лентой вверх, оставляя пластиковую основу прикрепленной, в закрываемой камере. Спешно; для пегилирования оставшегося отрицательного пространства, образованного прокладкой, раствор 150 мг mPEG-SPA (Laysan Bio, Inc., MW 5000) и 2 мг биотин-PEG-CO ₂ NHS (Laysan Bio, Inc., MW 5000), растворенные в 1 мл свежеприготовленного 100 мМ NaHCO ₃ (pH 8,2), пипеткой вносили в канал, созданный прокладку, чтобы оставить тюбик раствора ПЭГ. Перед закрытием камеры в камеру помещают небольшой резервуар для воды, чтобы предотвратить чрезмерное испарение, и оставляют покровные стекла на 3 часа.

Наконец, каждое покровное стекло тщательно промывали Milli-Q и сушили фильтрованным сжатым воздухом или азотным пистолетом. Эти пегилированные покровные стекла / прокладки можно хранить в вакууме ~ 2 месяца.

Покровное стекло было изготовлено путем создания отверстий либо в покровном стекле размером 50 × 50 × 0,4 мм (GPD-5504, UQG Optics), либо в покровном стекле 26 × 70 × 1 мм (Fisher Scientific, 12332098) с помощью стоматологического пескоструйного аппарата ( Kent Express, Danville Microetcher Mark II, 89516) с использованием оксида алюминия (Kent Express, Danville Aluminium Oxide Powder, 89517) или сверла Dremmel с алмазным сверлом (UKAM Industrial Superhard Tools, 2030008), соответственно, с промежутками, соответствующими концам прямоугольники вырезать, чтобы получилась прокладка.Впускные и выпускные отверстия сделаны так, чтобы плотно прилегать к полиэтиленовым трубкам для интрамедикона PE20 (Becton Dickinson, 427406) и PE60 (Becton Dickinson, 427416) соответственно.

Наконец, предварительно подготовленное пегилированное покровное стекло / прокладку удаляют из вакуума, снимают пластиковую липкую ленту и кладут клейкой стороной вверх на стол. Покровное стекло с отверстиями выравнивается и кладется сверху. Слегка надавите, чтобы скрепить ленту со стеклом.

Полиэтиленовые трубки Intramedic PE20 и PE60 нарезаются на длину 10 см и помещаются в противоположные отверстия того, что теперь охватывает каждую камеру для образцов.Трубка фиксируется эпоксидной смолой (RS Components, 756–0102).

После отверждения эпоксидной смолы ~ 20 мкл исходного стрептавидина (1 мг / мл стрептавидина) (Sigma-Aldrich, S4762) в физиологическом растворе с фосфатным буфером (Thermo Fisher, 10010015) вручную набирают в проточную камеру с помощью шприца и оставляют. при комнатной температуре в течение 30 мин. Наконец, блокирующий буфер втягивается в камеру вручную со скоростью для удаления любых пузырьков в трубках и воздушных карманов в камере, а затем выдерживается при 4 ° C до тех пор, пока не потребуется.

Магнитные микросферы, конъюгированные с дигоксигенином

Суперпарамагнитные микросферы против дигоксигенина диаметром 2,8 мкм получали путем конъюгирования фрагментов антител к дигоксигенину (1 мг / мл) (Sigma-Aldrich, 11214667001) с тозил-активированными магнитными микросферами M280 ( Thermo Fisher, 14203) согласно протоколу производителя.

Калибровочная ДНК-матрица

Олиго и праймеры для ДНК-матриц приведены в дополнительной таблице 2. Для калибровки силы мы использовали лямбда-матрицу ДНК с биотином и дигоксигенином на противоположных концах.Он был построен из 3-х частей.

Рукоятка, содержащая биотин, была получена путем амплификации дуплекса 574 п.н. изнутри pUC19 с прямым праймером олиго 1 и обратным праймером олиго 2 с использованием полимеразы Phusion (NEB, M0530L). ПЦР проводили в присутствии модифицированного dUTP, биотин-16-dUTP (Enzo, ENZ-42811), в молярном соотношении 1:20 с немодифицированной смесью dNTP. Каждую ручку очищали методом ПЦР (Qiagen, 28104) в 10 мМ трис-HCl, pH 8,5. ДНК разрывали с помощью Nt.BspQI (NEB, R0644L) при 50 ° C в течение 3 часов для создания 12-нуклеотидного 3′-выступа на матрице ПЦР, который комплементарен одному концу лямбда-ДНК.Роликовую ДНК нагревали при 65 ° C в течение 10 мин для создания желаемого выступа оцДНК в присутствии ~ 2 мкМ олиго 3, который предотвращает повторный отжиг выступа с комплементарной цепью. ДНК разделяли на 1,5% агарозе и очищали (Qiagen, 28704).

Рукоятку, содержащую дигоксигенин, получали путем амплификации дуплекса 574 п.н. изнутри pUC19 с прямым праймером олиго 1 и обратным праймером олиго 4 с использованием полимеразы Phusion (NEB, M0530L). ПЦР проводили в присутствии модифицированного dUTP, дигоксигенин-11-dUTP (Roche, 11093088910), в молярном соотношении 1:20 с немодифицированной смесью dNTP.Каждую ручку очищали образцом ПЦР в 10 мМ трис-HCl, pH 8,5. После нанесения Nt.BspQI при 50 ° C в течение 3 часов добавляли олиго 5 и нагревали при 65 ° C в течение 10 минут перед разделением на 1,5% агарозе, экстракцией и очисткой.

Лямбда-ДНК (NEB, N3011L) фосфорилировали полинуклеотидкиназой Т4 (NEB, M0201S) в течение 4 часов при 37 ° C, а затем нагревали при 70 ° C в течение 20 минут.

Для лигирования рукоятки, содержащей биотин, с лямбда-ДНК ~ 10-кратный молярный избыток рукоятки биотина нагревали с лямбда-ДНК до 65 ° C и оставляли охлаждаться до комнатной температуры на тепловом блоке перед лигированием (T4-лигаза, NEB, M0202L) на ночь при комнатной температуре.Затем его разделяли на 0,5% агарозном геле, вырезали и очищали с использованием электроэлюции с диализной трубкой MWCO 12–14 кДа (VWR, 734-0672). Наконец, ДНК концентрировали с помощью Vivaspin 500 10 кДа MWCO (Generon, VS0102).

Для лигирования ручки, содержащей дигоксигенин, ручки биотина / лямбда-ДНК ~ 20-кратный молярный избыток ручки дигоксигенина нагревали с ручкой биотина / лямбда-ДНК до 60 ° C в течение 1 мин и позволяли остыть до комнатной температуры перед лигированием ( Т4-лигаза, M0202L) в течение ночи при комнатной температуре.ДНК разделяли на 0,5% агарозном геле, вырезали и очищали с помощью электроэлюции с диализной трубкой MWCO 12–14 кДа (VWR, 734–0672). Срез геля удаляли из трубки и образец подвергали диализу против 10 мМ Трис pH 8 в течение ночи при 4 ° C. Наконец, ДНК концентрировали с помощью Vivaspin 500 10 кДа MWCO (Generon, VS0102).

Шаблон для разматывания

Шаблон 3′-клапана для исследований разматывания был построен из пяти частей.

Дуплекс длиной 2711 п.о. амплифицировали с помощью ПЦР из плазмиды pUC19 с использованием прямого праймера oligo 6 и обратного праймера oligo 7 с использованием полимеразы Phusion (NEB, M0530L) с последующей очисткой образца ПЦР в 10 мМ Tris-HCl, pH 8.5. После нанесения Nt.BbvCI (NEB, R0632S) при 37 ° C в течение 3,5 часов добавляли олиго 8 и 9, нагревали при 50 ° C в течение 10 минут и снова очищали. Наконец, образец разделяли на 1% агарозе перед экстракцией и очисткой геля.

Две дуплексы длиной 568 п.о. амплифицировали из плазмиды pUC19 с использованием прямого праймера oligo 1 и обратного праймера oligo 10 с помощью полимеразы Phusion (NEB, M0530L). ПЦР проводили в присутствии модифицированного dUTP, дигоксигенин-11-dUTP (Roche, 11093088910) или биотин-16-dUTP (Enzo, ENZ-42811) в молярном соотношении 1:20 с немодифицированной смесью dNTP.Каждую ручку очищали образцом ПЦР до 10 мМ трис-HCl, pH 8,5. После нанесения Nt.BbvCI (NEB, R0632S) при 37 ° C в течение 3,5 часов добавляли олиго 11, нагревали при 50 ° C в течение 10 минут и снова очищали.

Спейсер 3′-вилки был сформирован помещением эквимолярных соотношений олиго 12, олиго 13 и олиго 14 в 10 мМ трис-HCl (pH 8), 100 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА и нагревание до 85 ° C в течение 10 минут. , затем позволили отжигать путем охлаждения до комнатной температуры. Полосы были извлечены из 8% геля PAGE и очищены с использованием электроэлюции с диализной трубкой MWCO 12–14 кДа (VWR, 734-0672).Наконец, ДНК концентрировали с помощью Vivaspin 500 3-кДа MWCO (Generon, VS0192).

Спейсер 2 был сформирован помещением эквимолярных соотношений олиго 15, олиго 16 и олиго 17 в 10 мМ трис-HCl (pH 8), 100 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА, нагревали до 85 ° C в течение 10 минут, затем давали возможность отжиг путем охлаждения до комнатной температуры. Полосы были извлечены из 8% геля PAGE и очищены с использованием электроэлюции с диализной трубкой MWCO 12–14 кДа. Наконец, ДНК концентрировали с помощью Vivaspin 500 3 кДа MWCO.

Рукоятку дигоксигенина лигировали (Т4-лигаза, M0202L) с 3′-спейсером вилки при молярном соотношении 10: 1 в течение ночи, циклически меняя температуры 16 ° C, 20 ° C и 25 ° C с повторениями в 1 час.То же самое было повторено для ручки биотина и спейсера 2. Каждую из них разделяли на 1% агарозном геле перед экстракцией и очисткой. Эти два продукта лигировали (Т4-лигаза, NEB, M0202L) с матрицей размером 2,7 т.п.н. при комнатной температуре в течение 2 часов при равном весовом соотношении. Конечный продукт отделяли и экстрагировали из 0,8% агарозного геля перед очисткой и хранением при -20 ° C.

Массовая разматывающая матрица

Эквимолярное соотношение олигонуклеотидов 18 и 19 смешивали в буфере STE и инкубировали при 85 ° C в течение 3 минут, затем давали остыть до комнатной температуры.После разделения на 3% агарозном геле полосу, соответствующую шаблону вилки, вырезали и очищали в геле. После очистки матрицу метили радиоактивной меткой [ ³² P] -АТФ на 5′-концах с использованием T4 PNK. Для удаления избытка [ ³² P] -АТФ образец пропускали через колонки MicroSpin G50 (GE Healthcare, 27-5330-01), предварительно уравновешенные 10 мМ трис-HCl, pH 8,0, 20 мМ NaCl.

Шаблон шпильки для больших экспериментов с Т-антигеном

Шаблон шпильки для исследований раскручивания был сконструирован из пяти частей.

Дуплекс длиной 1046 п.н. амплифицировали с помощью ПЦР из плазмиды pUC19 с использованием прямого праймера oligo 20 и обратного праймера oligo 21 с использованием полимеразы Phusion (NEB, M0530L) с последующей очисткой образца ПЦР в 10 мМ Tris-HCl, pH 8,5. После нанесения Nt.BbvCI (NEB, R0632S) при 37 ° C в течение 3,5 часов добавляли олиго 8 и 9, нагревали при 50 ° C в течение 10 минут и снова очищали. Наконец, образец разделяли на 1% агарозе перед экстракцией и очисткой геля.

Ручки, содержащие дигоксигенин и биотин, получали, как описано для разматывающего шаблона.

Верхний линкер был сконструирован путем нагревания эквимолярных соотношений олиго 22 и олиго 12 в 10 мМ Трис-HCl (pH 8), 100 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА при 85 ° C в течение 10 минут, затем дали возможность отжига путем охлаждения до комнатная температура. Полосы были извлечены из 8% геля PAGE и очищены с использованием электроэлюции с диализной трубкой MWCO 12–14 кДа (VWR, 734–0672). Наконец, ДНК концентрировали с помощью Vivaspin 500 3 кДа MWCO (Generon, VS0192).

Нижний линкер был сконструирован путем нагревания эквимолярных соотношений олиго 17 и олиго 23 в 10 мМ Трис-HCl (pH 8), 100 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА при 85 ° C в течение 10 минут, затем дали возможность отжига путем охлаждения до комнатная температура.Полосы были извлечены из 8% геля PAGE и очищены с использованием электроэлюции с диализной трубкой MWCO 12–14 кДа. Наконец, ДНК концентрировали с помощью Vivaspin 500 3 кДа MWCO.

Рукоятку дигоксигенина лигировали (Т4-лигаза, M0202L) с верхним линкером при молярном соотношении 10: 1 в течение ночи, циклически меняя температуры 16 ° C, 20 ° C и 25 ° C с повторениями в 1 час. То же самое было повторено для ручки биотина и нижнего линкера. Каждый из них был разделен на 1,5% агарозном геле перед экстракцией и очисткой.

Продукты лигирования дигоксигенин / низший и биотин / верхний отжигали при эквимолярном соотношении в 10 мМ трис-HCl (pH 8), 100 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА. После нагревания при 50 ° C в течение 5 минут образец нагревали при 40, 35, 30 и 25 ° C, последовательно, каждый в течение 1 часа. Образец разделяли на 1% агарозном геле перед экстракцией и очисткой в ​​10 мМ Трис-HCl, pH 8,5, перед добавлением NaCl до 10 мМ.

Конечная шпилька была сформирована путем лигирования матрицы размером 1 т.п.н., ручки / линкеров и олиго 24 (T4-лигаза, NEB, M0202L) при молярном соотношении 1: 3: 30 в течение ночи, циклически меняя температуры 16 ° C, 20 ° C и 25 ° C с повторениями в 1 час.Конечный продукт отделяли и экстрагировали из 1% агарозного геля перед очисткой.

Очистка белка

Большой Т-антиген SV40 был экспрессирован в клетках насекомых и очищен с использованием моноклонального антитела, как описано ранее ¹⁵ . Вкратце, полноразмерный большой ген Т-антигена SV40 клонировали в pFastBac1 (ThermoFisher), который использовали для получения бакуловируса. Клетки Sf21, поддерживаемые в SF-900-III, были инфицированы вирусом (2 × 10 ⁸ БОЕ / мл) с использованием MOI 0.1 в течение 72 часов. Культуры объемом 1 л, выращенные в колбах на 5 л.

Антитело PAb419 связывали с гранулами протеина А-сефарозы (5 мг / мл ^-1 ) в PBS, инкубировали в течение ночи, вращая в холодной комнате. Гранулы промывали 15 мл 0,1 М бората натрия, pH 9,0, и ресуспендировали в 2 мл. 20 мл 0,0125 г / мл диметилпимелимидата ^-1 смешивали с шариками и инкубировали при вращении при комнатной температуре в течение 1 часа. Реакцию связывания останавливали инкубацией шариков в 0,2 М этаноламине, pH 8.0, вращаясь в течение 1 часа при комнатной температуре.

Осадки клеток ресуспендировали в 10 объемах осадка буфера для повторной суспензии L-Tag и инкубировали на льду в течение 15 минут. Суспензию центрифугировали при 25000 × g в течение 15 минут. Добавляли 0,5 объема буфера нейтрализации L-Tag и перемешивали. Образец сначала загружали в колонку, содержащую только белок А, уравновешенную загрузочным буфером L-Tag. Затем Flow-through загружали на колонку с конъюгированным с PAb419 протеином A, уравновешенную загрузочным буфером L-Tag.Колонку промывали 50 мл загрузочного буфера L-Tag, затем 50 мл промывочного буфера L-Tag, а затем 20 мл буфера L-Tag EG.

Большой Т-антиген элюировали 5–10 мл элюирующего буфера L-Tag перед диализом в течение ночи в диализном буфере L-Tag.

11 субъединиц Dm CMG (плазмиды, предоставленные Costa Lab) коэкспрессировали с использованием системы экспрессии бакуловируса ¹³ . Экспрессию и очистку комплекса проводили, как описано у Abid Ali et al. ¹³ и Ilves et al. ⁶ . С небольшими изменениями метод описан здесь.

Вкратце, после генерации бакмид для каждой субъединицы Dm CMG, клетки Sf21 (Structural Biology, STP, Институт Фрэнсиса Крика) использовали для начальной трансфекции и на последующей стадии амплификации вируса для получения запасов P2 без сыворотки. Среда для клеток насекомых SF-900TM III SFM (Invitrogen, 10902-096). Вирус амплифицировали для получения исходного материала P3 путем инокуляции 100 мл культур клеток Sf9 (Cell Services, STP, Институт Фрэнсиса Крика) (0.5 × 10 ⁵ мл ⁻¹ ) с 0,5 мл стоков P2 с MOI ≈ 0,1 для каждой субъединицы вируса. Полученные культуры инкубировали в стерильных колбах Эрленмейера на 500 мл в течение 4 дней при 27 ° C на циклическом шейкере при 100 об / мин. Супернатант фильтровали после центрифугирования при ~ 1000 × g в течение 15 минут.

4 л клеток Hi Five (Cell Services, STP, Институт Фрэнсиса Крика), культивируемых в среде Graces с добавлением 10% FCS (1 × 10 ⁶ мл ^-1 ), инфицировали свежим 11 субъединичным вирусом P3. культуры с MOI ≈ 5.Клетки инкубировали при 27 ° C и собирали через 60 часов. Полученные осадки сначала промывали PBS (Gibco, ThermoFisher, 70011044) с добавлением 5 мМ MgCl ₂ , ресуспендировали в 200 мл буфера для ресуспендирования C и замораживали в аликвотах по 10 мл на сухом льду перед хранением при -80 ° C, готовым для очистки. .

Осадки клеток размораживали и лизировали в гомогенизаторе Даунса (Wheaton, 40 мл Dounce Tissue Grinder) в течение по меньшей мере 50 ударов на 30 мл повторно суспендированных гранул клеток. KCl добавляли для достижения конечной концентрации 100 мМ в суспензии лизированных клеток.Лизат центрифугировали при 24000 × g в течение 10 минут. Супернатант инкубировали с 2 мл уравновешенных буфером C шариков агарозы M2 (Sigma Aldrich, F3165) в течение 2,5 часов при перемешивании конец за концом. Супернатант отбрасывали после центрифугирования при 200 × g в течение 5 минут, и шарики промывали 30 мл буфера C-100. Гранулы инкубировали с 5 мл элюирующего буфера с добавлением 200 мкг / мл пептида (DYKDDDDK, Peptide Chemistry, STP, The Francis Crick Institute) при комнатной температуре в течение 15 минут с перемешиванием конец за концом для элюирования связанных белков.Поток собирали, и процесс повторяли с дополнительными 4 мл буфера для элюирования, дополненными 200 мкг / мл пептида, и перемешиванием в течение 10 минут. Наконец, оба потока были объединены. Элюат пропускали через колонку HiTrap SPFF объемом 1 мл (GE Healthcare, 17-5054-01), уравновешенную буфером C-100. Проходящий поток собирали и объединяли с еще 4 мл буфера C-100, пропущенного через колонку.

Комплекс Dm CMG разделяли 20 мл градиента 100-550 мМ KCl с использованием колонки 5 / 50GL MonoQ (GE Healthcare, 17-5166-01).Фракции, в которых было элюировано Dm CMG, включали ~ 400-450 мМ KCl. Фракции CMG объединяли и разбавляли до ~ 150 мМ KCl. Для дальнейшего концентрирования образца объединенные фракции загружали в колонку MonoQ PC 1.6 / 5GL (GE Healthcare), уравновешенную буфером C-150-No Tween. 2 мл градиента 150-550 мМ KCl применяли для разделения комплекса Dm CMG, и фракции, содержащие Dm CMG, объединяли и подвергали диализу против 1 л буфера для диализа в течение 2 часов. Аликвоты мгновенно замораживали с использованием жидкого азота и хранили при -80 ° C.Очистку белка проверяли с помощью SDS-PAGE — исходное изображение геля, приведенное на дополнительном рис. 11а.

Анализ массового раскручивания

Матрица основной разворачивающейся вилки содержит дуплексную ДНК длиной 60 п.н. с участком polyT длиной 40 п.н. на 3′-конце для связывания CMG и GC-богатой областью на 5′-конце. Его метили радиоактивным изотопом [32P] -ATP на 5′-концах, используя T4 PNK, и инкубировали с CMG в реакционном буфере (25 мМ HEPES, pH 7,5, 10 мМ ацетат магния, 5 мМ NaCl, 5 мМ DTT, 0,1 мг / кг). мл BSA) в присутствии ATPɣS (500 мкМ) в течение 2 часов для достижения успешной загрузки геликазы на ДНК.В каждой реакции соотношение ДНК: белок поддерживали как минимум 1:50. Разматывание инициировали добавлением 10-кратного избытка АТФ (конечная концентрация 5 мМ) и прекращали через 5 минут добавлением буфера остановки реакции, содержащего 0,5% SDS и 20 мМ EDTA. Подложки разделяли с использованием 12% натурального полиакриламидного геля. Гели наносили на бумагу Whatman, экспонировали на экране фосфорного формирователя изображения в течение ночи и сканировали с использованием Typhoon 9500 (GE Healthcare) перед линеаризацией значений пикселей с помощью ImageJ. Исходный гель показан на дополнительном рис.11b.

Анализ раскручивания одномолекулярной ДНК

Для связывания конструкций ДНК с магнитными микросферами следует отметить, что значения, отмеченные знаком *, указывают на параметры, которые необходимо отрегулировать для получения оптимального количества отдельных молекул ДНК, привязанных между поверхностью стекла и микросферой в идеале. плотность.

Всего 1 мкл * конъюгированных с дигоксигенином магнитных микросфер ресуспендировали в 100 мкл блокирующего буфера, а супернатант удаляли после разделения с помощью магнита.Этот шаг был повторен. Затем микросферы ресуспендировали в 100 мкл связывающего буфера, а супернатант удаляли после разделения. После повторного суспендирования в 4 мкл * буфера для связывания добавляли 1 мкл * разведенной исходной ДНК-конструкции (~ 10 нг / мкл исходной смеси, разведенной в 500 * раз с помощью MilliQ) и оставляли на ротаторе пробирок (VWR, 445-2102, Stuart SB3) при комнатной температуре и 10 об / мин в течение 20 минут для предотвращения седиментации.

Микросферы, конъюгированные с ДНК, отделяют с помощью магнита и удаляют супернатант перед повторным суспендированием в 200 мкл блокирующего буфера.Этот буфер удаляется таким же образом и заменяется блокирующим буфером объемом 40 мкл *.

Чтобы связать ДНК-конъюгированные микросферы с поверхностью камеры для образцов, камеру для образцов сначала снимают с температуры 4 ° C, устанавливают на микроскоп и дают возможность достичь температурного равновесия. Выходная трубка соединяется с шестисторонним клапаном, а входная трубка помещается в пробирку Эппендорфа объемом 1 мл с блокирующим буфером при комнатной температуре. Первоначальный высокоскоростной импульс блокирующего буфера втягивается в камеру для образца для удаления пузырьков в проточной системе.200 мкл блокирующего буфера протягивается через камеру при 20 мкл мин. ^{— 1} с разумным щелчком впускной и выпускной трубки для первых 100 мкл для удаления захваченного воздуха.

Магнитная сила устанавливается равной ~ 0 пН, и при остановленном и изолированном потоке впускная трубка помещается в образец микросфер, конъюгированных с ДНК, перед тем, как поток 20 мклмин. камера. Поток останавливается и изолируется, чтобы гарантировать отсутствие движения микросфер из-за утечек или емкости в жидкости, а входное отверстие снова помещается в блокирующий буфер.

Поток возобновляется при 4 мкл мин. ^{— 1} для предотвращения кластеризации микросфер и в течение ~ 15 минут увеличивается до 10 мкл мин. ^{— 1} , а затем до 20 мкл мин. ⁻¹ пока не будут удалены все несвязанные микросферы. Этот этап открыт для настройки с целью оптимизации плотности присутствующих микросфер, связанных с одномолекулярной ДНК, часто с помощью осторожного щелчка выпускной трубки для удаления незакрепленных микросфер.

Наконец, усилие увеличивают и выбирают поле зрения с максимальным количеством отдельных ДНК-микросфер с идеальной плотностью для анализа и по крайней мере с двумя эталонными микросферами.При необходимости процедуру повторяют для увеличения плотности доступных молекул ДНК.

Справочная таблица (LUT) создается для обеспечения субпиксельного вертикального отслеживания микросфер. После того, как достаточное количество микросфер, конъюгированных с ДНК, будет привязано к стеклянной поверхности, 100 мкл загрузочного буфера CMG втягивается в камеру для образцов при 20 мкл мин. ^{— 1} . Устанавливается сила, которая будет использоваться в эксперименте. Фокус устанавливается чуть выше растянутой под действием силы молекулы ДНК и микросферы, а объектив шагает с шагом 100 нм над фокусом на расстояние, превышающее длину контура конструкции ДНК.На каждом этапе делается одно изображение, которое сохраняется для последующего анализа.

Анализ разматывания CMG

При отключенном и изолированном потоке сила устанавливается на 7 пН, затем 0 пН и обратно на 7 пН, каждое на ~ 25 с. Эти данные позже используются как для скрининга молекул ДНК правильной длины, так и в качестве точки отсчета для определения абсолютного положения дна камеры для образцов. Сила магнита установлена ​​на 8 пН.

Исходный CMG берется непосредственно из морозильника при –80 ° C и разбавляется до 42 нМ в загрузочном буфере CMG.Образец втягивается непосредственно в проточную камеру при 20 мкл мин. ^{— 1} . Через 8 минут при 8 пН сила магнита устанавливается на 3,5 пН на следующие 15 минут. Затем устанавливают требуемую силу и оставляют на ~ 70 секунд для записи контрольной точки. Затем 40–50 мкл (равных 4–5 объемам проточной камеры) уравновешенного по температуре рабочего буфера CMG втягивается в проточную камеру и поток останавливается. Эксперимент оставляют на 2 часа до его завершения, собрав ~ 0,5 миллиона кадров изображения.

Любая использованная камера для проб больше не используется.

Анализ раскручивания большого Т-антигена SV40

Для анализа шаблона шпильки поток отключают и изолируют, а силу устанавливают на 9 пН. Связки ДНК идентифицируются как шпильки путем изменения силы от 4 до 25 пН для открытия и закрытия конструкции. Сила возвращается к 9 пН. Для линейного анализа по шаблону поток отключают и изолируют, а силу устанавливают на 7 пН, затем 0 пН и обратно на 7 пН, каждое на ~ 25 с.Наконец, сила устанавливается на 20 пН.

Для обеих конструкций исходный большой Т-антиген разводят до 110 нМ (мономер) в 20 мкл рабочего буфера CMG. Образец нагревают при 37 ° C в течение 20 минут, а затем втягивают в проточную камеру при 20 мкл мин. ^-1 . Поток снова изолируется, и данные записываются.

Анализ данных

Необработанные изображения, сохраненные на жесткий диск, проходят несколько этапов рабочего процесса анализа. Здесь обсуждаются основные моменты.

Все микросферы, которые демонстрируют ожидаемое поведение и имеют ожидаемую длину при переходе от высокой к низкой силе, отслеживаются во времени по кадрам изображения, экспортированным во время эксперимента.Результирующие траектории положения z имеют положение z среднего значения по меньшей мере двух эталонных микросфер, за вычетом точки за точкой и установленным на нулевой уровень траектории предварительного разматывания.

Необработанные данные о положении по оси Z проходят фильтрацию нижних частот с использованием 6-секундного скользящего среднего среднего. Этот размер фильтра 6 с выбран из исследования движения связанной с ДНК микросферы без ферментов при силе 20 пН. Сумма квадратов разницы между точками необработанных и отфильтрованных данных отображается как функция размера фильтра (дополнительный рис.5а). При определенном размере фильтра преимущество дальнейшего увеличения имеет убывающую отдачу и служит только для сглаживания сигнала, а не для увеличения отношения сигнал / шум. Таким образом, размер фильтра выбирается с точки, в которой сумма различий между необработанными и отфильтрованными данными достигает плато.

Средние линейные скорости разматывания находятся путем линейной аппроксимации отфильтрованных данных.

Интервал прохождения выбирается путем определения удвоенного стандартного отклонения сигнала при фильтрации с размером фильтра, выбранным выше.Для иллюстрации на дополнительном рис. 5b изображено, как стандартное отклонение, σ , 80-секундной траектории без ферментов при 20 пН изменяется в зависимости от размера фильтра. Для выбранного размера фильтра 6 с σ = 10 пар оснований. Чтобы избежать ложного пересечения интервала и, следовательно, времени первого прохождения, интервал прохождения m устанавливается равным 20 bp = 2 σ ²⁸ . Время, необходимое для первого прохождения траектории на каждом последующем интервале, измерялось до достижения ее конца.Все времена первого прохода при одинаковых условиях были объединены и использованы в процедуре подбора. Извлеченные параметры устойчивы к изменениям в интервале прохода, м , за пределами связанных неопределенностей, поскольку выбор интервала для анализа исходных данных отражается в модели, подгоняемой уравнением. 2.

Распределение вероятностей времени первого прохождения модели (уравнение 2) использовалось для нахождения оценок максимального правдоподобия для параметров модели. Оценка максимального правдоподобия выполняется с использованием fmincon в MATLAB (Mathworks, 2014a-2017a).Выбор модели, однонаправленного обхода или предвзятого случайного обхода, а также количества включаемых пауз производился путем расчета байесовского информационного критерия (BIC) ⁸³ для каждого и выбора модели с минимальным BIC как наиболее подходящей. Этот критерий учитывает сложность модели, т. Е. Чем больше параметров, тем больше BIC. Более подробную информацию о подборе многопараметрических моделей можно найти в ссылках ^56,84 и других.

Для отображения данных время первого прохода было разделено на интервалы, нормализовано по ширине интервала и общему количеству выборок и нанесено на график.Параметры модели, найденные с помощью MLE, используются для наложения полученного аналитического выражения для модели, наилучшим образом описывающей наши данные. Отметим, что модель не подходит к гистограмме.

Планки ошибок стандартного отклонения на экспериментальных ячейках данных времени первого прохода и стандартное отклонение, указанное с оценочными значениями параметров, были рассчитаны посредством начальной загрузки с заменой 1000 раз.

Буферы

Список буферов и содержимого приведен в дополнительных методах.

Краткое изложение отчета

Дополнительная информация о дизайне исследования доступна в Резюме отчета по исследованию природы, связанном с этой статьей.

Расслабьтесь | Книга Нила Шустермана | Официальная страница издателя

Получите БЕСПЛАТНУЮ электронную книгу, присоединившись к нашему списку рассылки сегодня! Кроме того, получите рекомендации для следующего чтения Книжного клуба.

Расслабьтесь

Нил Шустерман
О книге

В недалеком будущем подростки Коннор, Риса и Лев спасаются бегством.После Второй гражданской войны, между силами, выступающими за выбор, и силами, выступающими за жизнь, Соединенные Штаты теперь позволяют родителям развязать своих нежелательных и трудных детей в возрасте от тринадцати до восемнадцати лет: их тела хирургическим путем извлекаются, а все органы и ткани используются у других людей. По закону дети не считаются мертвыми, они «живут в разделенном штате». Но Коннор, Риса, Лев и тысячи других подростков, которым предстоит «расслабиться», не считают это таким.Вместо этого они предпочитают «пнуть самоволку» или убежать. Unwind следует за этими тремя по всей стране, когда они путешествуют вместе, разделяются и снова встречаются, когда их судьбы пересекаются в лагере урожая, где они должны быть развернуты.
Предварительное исследование / задания

Попросите учащихся исследовать тех, кто в прошлом помогал людям, находящимся под угрозой исчезновения. Они могут изучить Подземную железную дорогу до Гражданской войны, обширную сеть людей, которые помогли беглым рабам пробиться на свободу.Они также могут исследовать истории тех, кто помогал евреям бежать от нацистов, включая Оскара Шиндлера, Рауля Валленберга и Чиуне Сугихара.

Действие романа происходит после «Второй гражданской войны». Настоящая Гражданская война велась прежде всего из-за рабства. Узнайте о недавних гражданских войнах в других странах. За какие вопросы — например, религия, раса или политика — ведутся споры? В небольших группах обсудите идею второй гражданской войны в этой стране и то, из-за чего она может вестись.Как вы думаете, это могло случиться здесь?

Узнайте, сколько людей сегодня решают пожертвовать свои органы после смерти. Как это сделать? Как обрабатываются и доставляются органы? Сколько жизней они спасают? Спросите других студентов, сколько из них намерены пожертвовать свои органы. Организуйте дебаты: обсудите, стоит ли жертвовать органы. Если да, то почему так мало людей этим занимаются?
Темы для обсуждения
1. Что бы вы почувствовали, если бы узнали, что собираетесь расслабиться? Что бы вы сделали? Если вы не хотели соглашаться с этим, но не могли убежать, как Коннор и другие в романе, какие еще варианты у вас были бы?

2.Как бы вы себя чувствовали, если бы попали в аварию или у вас было редкое заболевание, и вы могли бы вылечиться, только если бы ваши поврежденные органы были заменены частями, взятыми у расслабленных подростков? Что бы вы выбрали делать? Что, если бы вы наверняка умерли, если бы отказались от деталей? Что, если бы в аварию попал не вы, а кто-то, кого вы любите (родитель, брат или сестра)? Ваш ответ был бы другим?

3. Вы только что узнали, что человека, сидящего рядом с вами, собираются раскрутить. Придумайте десять веских причин, почему они НЕ должны быть такими.Помните, от этого может зависеть их жизнь!

4. Когда , как вы думаете, имеет место история? В книге никогда не указывается год. Сколько лет в будущем это может быть? Какие подсказки намекают, сколько времени прошло? Какие компании или продукты названы? Какие социальные нормы, которые, по вашему мнению, изменились или остались прежними? В чем сходство между миром Unwind и нашим собственным миром? Какие отличия?

5.С кем из трех главных героев, Коннором, Рисой или Львом, вы больше всего отождествляете себя? Почему? Что у вас общего? Какие из их качеств работают на них, а какие делают их жизнь тяжелее? От каких ваших черт вы хотели бы отказаться? Что бы вы хотели сохранить?

6. По ходу книги Коннор и Риса отделяются от Льва, который какое-то время путешествует с другим персонажем. Как вы думаете, почему автор решил разделить повествование на две отдельные нити? Как вы думаете, чего это достигнет? Как это влияет на эволюцию персонажей?

7.Сравните сходства и различия путешествия Лева с Сайрусом в Джоплин, штат Миссури, в фильме « Unwind » с путешествием Гека с Джимом по реке Миссисипи в романе « Гекльберри Финн, ».

8. Во время транспортировки в возможное безопасное место некоторые из детей в бегах задаются вопросом: «Что лучше: умереть или размотаться?» Если бы у вас был выбор, что бы вы выбрали? Почему?

9. Еще один вопрос, который обсуждают дети в книге: «Если каждая часть вас все еще жива, но внутри кого-то другого, вы живы или вы мертвы?» Они также задаются вопросом, может ли сознание существовать, даже если оно распространяется, и если душа остается нетронутой.Что вы думаете?

10. Какие взрослые в рассказе изображены с симпатией? Что, по вашему мнению, не вызывает симпатии? Есть ли переход от одного к другому? Как автор описал этих персонажей, чтобы вы так или иначе восприняли их?

11. Рисе поручают играть в группе в Harvest Camp, исполняя оптимистичные мелодии, пока подростки собираются расслабиться. Риса находится в противоречии: она знает, что игра в группе продлит ей жизнь дольше, но это за счет других, и ее радость от того, что она играет на пианино, сочетается с ужасом от осознания того, что происходит вокруг нее.Как бы вы себя чувствовали в этой ситуации? Вы бы согласились на эту должность? Были ли в истории подобные ситуации?

12. Какие положительные последствия, по вашему мнению, будет реализовано в обществе, где существует раскручивание? Какие есть минусы? Как вы думаете, негатив перевешивает позитив или наоборот?

13. Эфемизм — это мягкое слово или фраза, которые используются для обозначения чего-то неприятного или смущающего. «Жить в разделенном государстве» — это эвфемизм, который чиновники в романе используют вместо «раскручивания».«Другой эвфемизм в романе — это« лагеря урожая »вместо« разматывающих сооружений ». Можете ли вы вспомнить какие-либо широко используемые эвфемизмы в реальной жизни? Как вы думаете, почему люди используют эвфемизмы?

14. В романе разворачивание. становится крупным бизнесом, так как на больных и пострадавших от несчастных случаев, которым требуются свежие органы, можно заработать много денег, а население смотрит в другую сторону, не учитывая источник. Есть ли какие-нибудь современные ситуации, о которых вы можете подумать, где этика были скомпрометированы из-за денег или просто потому, что об этом проще не думать? Предскажите ситуацию в будущем, когда жадность или отрицание могут победить мораль.

15. Представьте, что вам предлагают присоединиться к Clappers, футуристическим террористам из романа. Как бы вы ответили? Что бы вы им сказали?

16. Гнев Коннора и отсутствие контроля над импульсами часто становятся для него проблемой, пока он не научится контролировать и направлять свои эмоции. Вы когда-нибудь чувствовали, что ваши импульсы сильнее вашей воли? Какие стратегии вы используете, чтобы контролировать свои чувства? Они работают?

17. Хулиган, Роланд, усложняет жизнь Коннору и Рисе с того момента, как они его встретят.Что вы думаете о его окончательной расплате? Вы думали, это было честно? Было ли это удовлетворительным, или это заставило вас поежиться, или и то, и другое? Почему?
Действия

В романе Соня, владелица антикварного магазина, заставляет каждого подростка, которому она помогает, написать письмо тому, кого он любит. Напишите собственное письмо тому, кого любите, и, как дети в романе, вложите в него все, что вы хотите сказать этому человеку, хорошее и плохое. Вы бы хотели показать это письмо тому, кому вы его написали? Почему или почему нет? А через три-четыре года?

Составить завещание; вместо имущества вы отдаете свою личность.Составьте список своих личностных качеств. Какие части вашей личности (чувство юмора, решимость и т. Д.) Вы бы передали и кому?

Подготовьте свидетельские показания для Конгресса, когда они начнут слушания о статусе Билля о жизни. Напишите свое свидетельство с точки зрения подростка, которого планируется развязать, или от кого-то, чья жизнь была спасена, получив части тела от раскрученного подростка. Проведите слушания, на которых несколько студентов поделятся своим свидетельством с классом. Затем обсудите, нужно ли менять закон.

Группа Рисы среди других песен играет «Don’t Fear the Reaper» для подростков, которым предстоит расслабиться. Составьте список песен, которые ваша группа сыграла бы, если бы вы выступали в Harvest Camp. Объясните свой выбор.

В романе персонажи прибывают на «кладбище», безопасное убежище для подростков, которым предстоит расслабиться. В группе придумайте другое место, где собрались подростки. Опишите, как функционирует ваше собственное импровизированное сообщество и в чем состоит каждая из ваших должностей.Составьте список из десяти правил ладони в духе «Десяти требований» адмирала.

В конце романа, когда разные люди, получившие части от одного человека, объединяются, они начинают действовать как единое целое. В группе попробуйте выполнить актерское упражнение, известное как «Машина». Один человек делает одно и то же повторяющееся движение снова и снова. Затем к первому присоединяется второй человек, повторяя другое, но дополняющее движение. Затем присоединяются другие, по одному.В конце концов, у вас будет «машина» с множеством различных частей, каждая из которых выполняет отдельные, но связанные движения, действуя как единое целое.

Попробуйте рассказать историю, в которой каждый человек, один за другим, может пожертвовать только одно предложение. Цель состоит не в том, чтобы сбить историю с толку или быть смешной, а в том, чтобы сделать историю последовательной. Это можно сделать? Имел ли смысл рассказ?

Напишите газетную статью через год после окончания романа. Какое новостное событие только что произошло (например, новые выборы, бунт, новый теракт)? Изменило ли это что-нибудь фундаментальное в обществе или Билле о жизни? Закон отменен?

Персонажи

Коннор Ласситер : шестнадцатилетний проблемный ребенок.Когда он узнает, что его родители подписали приказ о закрытии, он убегает в поисках места, где можно спрятаться, пока ему не исполнится восемнадцать.

Риса Уорд : пятнадцать лет, сирота в государственном доме. Она убегает, когда администраторы подписывают приказ о ее размотке, и по необходимости присоединяется к Коннору в поисках безопасности.

Лев Колдер : десятый и самый младший ребенок в его религиозной семье, «десятина», рожденная для того, чтобы ее разложить, когда ему исполнится тринадцатый день рождения.Его «похищает» Коннор, который хочет спасти его от судьбы.

Пастор Дан : служитель Льва и его духовный наставник. Пастор Дэн поддерживает Льва, когда он приближается к своему расслаблению, но в тот момент, когда Коннор освобождает Льва, он призывает его бежать.

Ханна Стейнберг : учительница средней школы, которая прячет Коннора и Рису в классе.

Соня : владелица антикварного магазина, пряча подростков в самоволку в своем подвале, первый шаг на их окольном пути к безопасности.

Май : азиатская девушка в самоволке, которую Коннор и Риса встречают, скрываясь.

Роланд : манипулятивный, безжалостный хулиган, продолжающий конфронтацию с Коннором.

Хайден : язвительный, но вдумчивый самоволка с отношением.

Сайрус Финч (CyFi) : сбежавший подросток, которого встретил Лев. Сайрус, получивший кусок мозга от раскрутки, ищет что-то, что пытается сказать ему раскрученный ребенок в его голове.

Адмирал : взрослый, бывший военнослужащий ВМС США, управляющий «кладбищем», где в целях безопасности остаются многие подростки в самоволке. Адмирал был одним из составителей Билля о жизни.
Расслабьтесь Сленг

Самоволка : сбежавший из дома подросток, которого планируется расслабить, надеющийся дожить до 18 лет; говорят, что он «пинает самоволку».

Bill of Life : закон, устанавливающий раскручивание.

Boeuf : солдат, мужчина или женщина (от французского слова «говядина»)

Chop Shop : операционная, в которой тела подростков разбирают хирургическим путем.

Clappers : террористы-смертники, заменившие свою кровь смесью нитроглицерина. Они взрывают себя, хлопая в ладоши.

Лагерь для сбора урожая (ранее называвшееся «разматывающими сооружениями»): где размещаются подростки, ожидающие размотки, а также где проводится процедура.

Хамфри Данфи : городская легенда о расслаблении, родители которого сходят с ума от горя и убивают всех получателей частей тела своего сына, пытаясь собрать его заново.

Juvey-cops : Офицер полиции, специализирующийся на уничтожении самовольных полицейских.

«Жизнь в разделенном состоянии»: эвфемизм для разматывания.

StaHo: Государственные дома, детские дома, где подопечные штата остаются до своего восемнадцатилетия или до тех пор, пока их не отправят на раскладку.

Аист: младенцев, оставленных на пороге. Домовладелец обязан содержать и воспитывать ребенка.

Десятина: ребенок в религиозной семье, рожденный и воспитанный для разматывания в качестве благотворительного акта.

Умбер: социально приемлемый способ описания афроамериканца. (В отличие от sienna , социально приемлемого способа описания человека европеоидной расы.)

Об авторе

Нил Шустерман написал множество романов для молодежи, в том числе Everlost, Full Tilt, и Downsiders , который был номинирован на двенадцать государственных премий по чтению и был признан лучшей книгой ALA для молодых взрослых и «Быстрый выбор» для сопротивляющихся молодых взрослых читателей.Он также пишет сценарии для кинофильмов и телешоу, в том числе Pixel Perfect для канала Disney. Он живет в Южной Калифорнии со своими четырьмя детьми, ни один из которых никогда не вырастет. По крайней мере, он так говорит.