Что означает зе рко: РКО для ИП и ООО – что это такое

Содержание

что это, кому нужна услуга, от чего зависят тарифы, как сделать выбор

Тарифы РКО — первое, что должно интересовать юридическое лицо или ИП при обращении в финансовое учреждение и открытии расчетного счета. Но при выборе варианта часто возникают вопросы — на что ориентироваться при выборе расчетно-кассового обслуживания банка, что входит в РКО, и какой тариф будет наиболее выгодным для клиента. Эти моменты рассмотрим подробно.

Что такое РКО: кому нужна услуга

Расчетно-кассовое обслуживание — комплекс услуг, касающийся содержания расчетного счета, и предоставляемый банками клиентам. Задача расчетно-кассового обслуживания — в обеспечении бесперебойной работы и ускорения операций с деньгами на расчетном счету. Банковские услуги не бесплатны. Почти за каждое действие финансовое учреждение взимает определенную плату.

В желании подключить как можно больше клиентов, банки предлагают полноценные тарифы РКО,  включающие в себя определенный набор услуг. От «наполнения» тарифного плана зависит его конечная стоимость. Сегодня выделяется два основных предложения:

  • Для крупных компаний, совершающих ежедневно большой объем транзакций. Для таких клиентов финансовое учреждение предлагает расширенный вариант расчетно-кассового обслуживания с соответствующей ценой. Общие затраты компаний снижаются за счет объема проводимых платежей.
  • Для ИП, который только развивают бизнес. В этом случае тарифы подразумевают меньший набор услуг, что позволяет сэкономить на расходах.

Читайте также — Условия открытия расчетного счета

От чего зависят тарифы РКО?

При выборе банка и расчетно-кассового обслуживания важно понимать, из каких составляющих формируется этот параметр.

Тарифы РКО включают:

  • Расходы на открытие расчетного счета. Этот платеж делается один раз при оформлении услуги.
  • Ежемесячные выплаты за обслуживание.
    В отличие от прошлой статьи расходов, здесь объем затрат выше. В частности, для ИП такие платежи могут составлять существенную часть получаемой прибыли.
  • Ставка по отправке платежного поручения. Эта часть тарифа РКО для ИП и юридических лиц существенно влияет на конечный платеж.

Кроме перечисленных элементов, расчетно-кассовое обслуживание включает и ряд других тарифов — за снятие наличности по чеку, эмиссию корпоративной карты, прием платежей, реализацию зарплатного проекта, снятие наличных по чеку и прочие. В сумме формируется общий тариф РКО, выплаты по которому ложатся на «плечи» ИП или юридического лица.

Если говорить в целом, все составляющие плана условно делятся на три категории — одноразовые платежи, периодические выплаты и перечисление средств за определенные операции.

При выборе наибольшее внимание уделяется трем критериям

:

  • Расходам на открытие.
  • Стоимость ежемесячного обслуживания.
  • Платеж за проведение поручений банковскими учреждениями.

Как выбрать тариф РКО для юридических лиц и ИП?

Знание основных составляющих тарифного плана еще не дает ответы на вопросы, касающиеся выбора расчетно-кассового обслуживания. Здесь стоит учесть следующие советы:

  • Выбирайте тарифы РКО, которые больше подходят именно под ваш вид бизнеса.
  • Для ИП, открывающих расчетный сет для оплаты арены или налогов, подойдет расчетно-кассовое обслуживание с наименьшим ежемесячным платежом.
  • Проследите, чтобы интернет-банкинг входил в выбираемый план.
  • Выбирайте тарифы РКО с наименьшей комиссией за снятие наличности (если в процессе деятельности приходится часто совершать такие операции).
  • Если ежемесячный объем платежных операций превышает сотню, лучше отдать предпочтение безлимитному плану.
  • Новичкам лучше отдавать предпочтение тарифам расчетно-кассового обслуживания, в которых отсутствуют стартовые издержки.

В завершение стоит отметить, что многие банки предлагают льготные тарифы РКО, поэтому при выборе подходящего варианта не нужно делать спешных решений. Как юридическому лицу, так и ИП необходимо проанализировать предложения, оценить возможности и принять решение.

Кассовое обслуживание в банке — оформить операционно-кассовое обслуживание для юридических лиц, тарифы Альфа-Банк

Давайте рассмотрим подробнее, что такое кассовое обслуживание юридических лиц (ООО, ИП и др.) в банке. В наши дни эта банковская услуга высоко востребована коммерческими предприятиями, а также индивидуальными предпринимателями.

В банковской практике кассовыми называются операции по зачислению денежной выручки на счёта в банке и по выдаче наличных денежных средств на различные цели.

Кассовое обслуживание клиентов производится на основе договора на кассовое обслуживание, а принципы его организации устанавливает Банк России. Осуществляется такое обслуживание в течение операционного дня, при этом все принятые наличные необходимо в тот же день оприходовать и сделать проводки по счётам клиентов.

Кассовое обслуживание является частью расчётно-кассового обслуживания (РКО):

открытие и обслуживание счётов в рублях, иностранной валюте и валюте с ограниченной конвертацией

безналичные операции в рублях и иностранной валюте

конверсионные операции — обмен валюты

кассовое обслуживание — внесение и снятие наличных

начисление и выплата процентов на остаток средств на счётах

исполнение функций агента валютного контроля

Сегодня Альфа-Банк выбирает каждый пятый предприниматель, ведь это один из самых надежных банков с 28-летней историей успеха на российском финансовом рынке.

Удобный интернет-банк для предпринимателей и современный мобильный банк обеспечат вам доступ к счёту с компьютера, планшета или смартфона в любое время.

6 преимуществ кассового обслуживания в Альфа-Банке

Бесплатное открытие счёта и подключение интернет-банка

Бесплатный выпуск карты для работы с наличными

Бесплатные платежи в бюджет и бизнес-клиентам Альфа-Банка

Переводы без комиссии на личный счёт в Альфа-Банке до 100 000 руб / мес.

Круглосуточные платежи другим клиентам Альфа-Банка

Бонусы от партнеров банка на сумму свыше 130 000 руб

Сократите стоимость расчётно-кассового обслуживания, выбрав пакет услуг для бизнеса, или получите 3 месяца бесплатного обслуживания при оплате сразу за 9 месяцев. Открытие счёта в Альфа-Банке позволит получать скидки на товары и услуги у партнеров банка и пользоваться полезными сервисами для бизнеса.

Мы обсудили понятие «кассовое обслуживание»: что это, сколько это может стоить вашей компании и другие нюансы. Осталось оформить его в Альфа-Банке, предлагающем услуги кассового обслуживания корпоративных счётов предприятий по выгодной цене.

Другие предложения по расчётно-кассовому обслуживанию

Расчетно-кассовое обслуживание в банке физических и юридических лиц, очень быстрое РКО в Москве

  Подтверждаю своё согласие на обработку Банком моих персональных данных

Настоящим я даю свое согласие ПАО «МОСКОВСКИЙ КРЕДИТНЫЙ БАНК», место нахождения: 107045, г. Москва, переулок Луков, д.2, стр. 1, (далее — Банк), в соответствии с Федеральным законом от 27.07.2006 № 152-ФЗ «О персональных данных» на обработку моих персональных данных и подтверждаю, что, дав такое согласие, я действую добровольно и в своих интересах. Под обработкой персональных данных в указанном законе понимается любое действие (операция) или совокупность действий (операций), совершаемых с использованием средств автоматизации или без использования таких средств с персональными данными, включая сбор, запись, систематизацию, накопление, хранение, уточнение (обновление, изменение), извлечение, использование, передачу (предоставление, доступ), получение, объединение, блокирование, удаление, уничтожение персональных данных, Под персональными данными понимаются: — сведения, указанные в настоящей заявке; — сведения, автоматически формируемые в процессе работы с сайтом Банком, в том числе, но не ограничиваясь: cookie-файлы; IP-адреса для информации о геолокации; информация об операционной системе и Web-браузере, установленных на устройстве, с которого осуществляется доступ к сайту Банка; количество просмотров/кликов по объявлениям Банка, размещенным на других сайтах; количество посещений Web-сайта Банка.

Целью обработки персональных данных является: — принятие Банком решения о предоставлении организации, представителем которой я являюсь, любых банковских услуг; — заключение между Банком и организацией, представителем которой я являюсь любых договоров и их дальнейшего исполнения; — формирования Банком клиентской базы, — предоставления мне, как представителю организации, информации об оказываемых Банком услугах; — маркетинг и реклама, в том числе создание и рассылка целевых рекламных рассылок; — осуществление технического управления интернет-сервисами Банка, а также для проведения анализа функционирования и улучшения работы интернет-сервисов Банка — проведение статистических и иных исследований. Обработка Персональных данных осуществляется Банком в объеме, который необходим для достижения каждой из вышеперечисленных целей. Я признаю и подтверждаю, что в случае необходимости Банк вправе в объеме необходимом для достижения указанных выше целей передавать мои Персональные данные третьим лицам, их агентам и иным уполномоченным ими лицам, а также в случае необходимости представлять таким лицам соответствующие документы, содержащие мои Персональные данные с соблюдением требований законодательства РФ.
Банк прилагает все возможные усилия и предусмотренные законодательством РФ меры для того, чтобы избежать несанкционированного использования персональных данных. Я уведомлен и соглашаюсь с тем, что Банк не несет ответственности за возможное нецелевое использование моих персональных данных, произошедшее из-за технических неполадок в программном обеспечении, серверах, компьютерных сетях, находящихся вне контроля Банка (за исключением случаев передачи персональных данным третьим лицам, описанных выше), или в результате противоправных действий третьих лиц. Настоящим подтверждаю, что данное согласие действует до момента его отзыва. Согласие может быть отозвано путем предоставления мною письменного уведомления Банку при условии установления моей личности. При этом признаю, что в случае отзыва согласия, Банк вправе не прекращать обработку моих Персональных данных и не уничтожить их в случаях, предусмотренных законодательством РФ, в том числе, если сроки хранения Персональных данных, предусмотренные законодательством РФ, не истекли.

Расчетно-кассовое обслуживание

АлександровБарнаулБелгородБрянскВичугаВладимирВолгоградВоронежДобрянкаДомодедовоЕкатеринбургЖуковскийЗаречныйИвановоКазаньКалининградКалугаКинешмаКоломнаКоролевКостромаКрасновишерскКраснодарКраснокамскКузнецкКунгурЛабинскМоскваНижний НовгородНовосибирскОбнинскПензаПермьПодольскРодникиРостов-на-ДонуРыбинскРязаньСамараСанкт-ПетербургСаратовСергиев ПосадСоликамскСтарый ОсколСыктывкарТейковоТюменьФурмановХабаровскШуяЩелковоЯрославль

ДО «Домодедово» г. Домодедово, мкр. Западный, Каширское шоссе, д. 70, пом. 4 ДО «Жуковский», ул. Энергетическая, д. 2ТКБ БАНК ПАО ДО «Коломенский», ул. Октябрьской революции, д.293 ДО «Кунцевский», ул. Ярцевская, д. 19, 2-й этаж ДО «Петровский», 1-й Колобовский переулок, д.6 стр.3 ДО «Подольский», ул. Большая Серпуховская, д. 14 ДО «Покровка», ул. Покровка, д.24/2, стр.1 ДО «Сергиево-Посадский», пер.Зеленый, д.15 ДО «Сущевский Вал», ул. Октябрьская, 36 ДО «Щелковский», ул. Центральная, д.17 ДО «Королёвский», ул. Гагарина 12/14 ОО «Калужский», ул. Кропоткина, д. 2 ОО «Алтайский» ТКБ БАНК ПАО, пр-т Ленина 103-а/Профинтерна, д. 39 ОО «Белгородский», Народный бульвар, дом 111 Брянский филиал, ул. Пролетарская, д.1 Операционный офис «Воронежский» ТКБ БАНК ПАО ОО «Добрянский» ТКБ БАНК ПАО ОО «Екатеринбургский» ТКБ БАНК ПАО, ул.Чернышевского, д.16 ОО «Калининградский» ТКБ БАНК ПАО ОО «Красновишерский» ТКБ БАНК ПАО, ул. Советская, д.21 ОО «Краснодарский» ТКБ БАНК ПАО, ул. им. Фрунзе, д.169 ОО «Краснокамский» ТКБ БАНК ПАО, ул. Школьная, д.14 ОО «Кунгурский» ТКБ БАНК ПАО ОО «Лабинский» ТКБ БАНК ПАО, ул. Красная, д. 25/1 ОО «Нижегородский», ул. Ульянова, д.31 ОО «Новосибирский» ТКБ БАНК ПАО, ул. Коммунистическая, 35 ОО «Обнинский», ул. Гагарина, д.13 ОО «Пермский» ТКБ БАНК ПАО, ул. Сибирская, д.2 ОО «Ростовский» ТКБ БАНК ПАО, г. Ростов-на-Дону, ул. Советская, д. 22/2 Операционный офис «Рыбинский» ТКБ БАНК ПАО, ул. Крестовая, д. 120 Операционный офис «Рязанский» ТКБ БАНК ПАО, ул.Есенина, д.110 Операционный офис «Самарский №1» ТКБ БАНК ПАО, ул.Галактионовская, д. 187/Ярмарочная, д. 7 Операционный офис «Самарский» ТКБ БАНК ПАО, ул.Стара-Загора, д.52 ОО «Санкт-Петербургский» ТКБ БАНК ПАО ОО «Соликамский» ТКБ БАНК ПАО, ул. Матросова, д.8 ОО «Сыктывкарский» ТКБ БАНК ПАО ОО «Тюменский», ул. Малыгина, д. 4 Операционный офис «Хабаровский» ТКБ БАНК ПАО Операционный офис «Ярославский» ТКБ БАНК ПАО, ул.Чайковского, д. 26 ДО «Воронцовский», ул.Воронцовская, д.27/35 ИТБ Братиславский ИТБ Головной офис ИТБ Дмитровский ИТБ ДО Аэропорт ИТБ ДО Земляной Вал ИТБ ДО Университетский ИТБ Звенигородский ИТБ Люберецкий ИТБ Можайский ИТБ Октябрьское поле ИТБ Петровский ИТБ Серпухов ИТБ Электростальский ИТБ Операционный офис «Александровский» ИТБ Операционный офис «Вичугский» ИТБ Операционный офис «Владимирский» ИТБ Операционный офис «Вознесенский» ИТБ Операционный офис «Октябрьский» ИТБ Операционный офис «Казанский» ИТБ Операционный офис «Кинешемский» ИТБ Операционный офис «Костромской» ИТБ Операционный офис «Родниковский» ИТБ Операционный офис «Старооскольский» ИТБ Операционный офис «Тейковский» ИТБ Операционный офис «Фурмановский» ИТБ Операционный офис «Шуйский» ИТБ Операционный офис «Волгоградский» ИТБ Операционный офис «Заречный» ИТБ Операционный офис «Кузнецкий» ИТБ Операционный офис «Пензенский» ИТБ Операционный офис «Саратовский»

РКО для бизнеса, открыть расчетный счет для бизнеса

ОписаниеПакет услуг для преодоления кризисаПакет услуг для преодоления кризисаТариф для пострадавшего бизнеса, который хочет сэкономитьТариф для компаний, которые работают и стремятся к выгодеТариф для крупных компаний с большим количеством платежей
Открытие счета бесплатно бесплатно бесплатно бесплатно бесплатно
Обслуживание в месяц 0 ₽ 0 ₽ 350 ₽ 550 ₽ 10 000 ₽
Заплатить контрагенту внутри банка бесплатно бесплатно бесплатно бесплатно бесплатно
Заплатить контрагенту в другой банк 0 ₽

199 ₽ с 6-го платежа

199 ₽

0 ₽

199 ₽ с 4-го платежа

199 ₽

28 ₽ 23 ₽ 0 ₽
Перевести на счет частным лицам 0%
  • до 200 000 ₽ — 0%
  • от 200 000 до 300 000 ₽ — 1%
  • от 300 000 до 1 500 000 ₽ — 1. 7%
  • от 1 500 000 до 5 000 000 ₽ — 3.5%
  • свыше 5 000 000 ₽ — 8%
до 200 000 ₽ в месяц
0%
  • до 150 000 ₽ — 0%
  • от 150 000 до 300 000 ₽ — 1%
  • от 300 000 до 1 500 000 ₽ — 1.7%
  • от 1 500 000 до 5 000 000 ₽ — 3.5%
  • свыше 5 000 000 ₽ — 8%
до 150 000 ₽ в месяц
0.95 %
  • до 500 000 ₽ — 0.95 %
  • от 500 000.01 до 2 000 000 ₽ — 3%
  • свыше 2 000 000.01 ₽ — 5%
до 500 000 ₽ в месяц
0.95 %
  • до 500 000 ₽ — 0.95 %
  • от 500 000.01 до 1 000 000.00 ₽ — 1.5%
  • от 1 000 000.01 до 2 000 000. 00 ₽ — 2%
  • от 2 000 000.01 до 3 000 000.00 ₽ — 3%
  • от 3 000 000.01 до 5 000 000.00 ₽ — 4%
  • свыше 5 000 000 ₽ — 5%
до 500 000 ₽ в месяц
0.95 %
  • до 500 000 ₽ — 0.95 %
  • от 500 000.01 до 1 000 000.00 ₽ — 1.5%
  • от 1 000 000.01 до 2 000 000.00 ₽ — 2%
  • от 2 000 000.01 до 3 000 000.00 ₽ — 3%
  • от 3 000 000.01 до 5 000 000.00 ₽ — 4%
  • свыше 5 000 000.01 ₽ — 5%
до 500 000 ₽ в месяц
Снять наличные 5% 5% 0.95 %
  • до 500 000 ₽ — 0.95 %
  • от 500 000.01 до 2 000 000 ₽ — 3%
  • свыше 2 000 000. 01 ₽ — 5%
до 500 000 ₽ в месяц
0.95 %
  • до 500 000 ₽ — 0.95 %
  • от 500 000.01 до 1 000 000.00 ₽ — 1.5%
  • от 1 000 000.01 до 2 000 000.00 ₽ — 2%
  • от 2 000 000.01 до 3 000 000.00 ₽ — 3%
  • от 3 000 000.01 до 5 000 000.00 ₽ — 4%
  • свыше 5 000 000 ₽ — 5%
до 500 000 ₽ в месяц
0.95 %
  • до 500 000 ₽ — 0.95 %
  • от 500 000.01 до 1 000 000.00 ₽ — 1.5%
  • от 1 000 000.01 до 2 000 000.00 ₽ — 2%
  • от 2 000 000.01 до 3 000 000.00 ₽ — 3%
  • от 3 000 000.01 до 5 000 000.00 ₽ — 4%
  • свыше 5 000 000.01 ₽ — 5%
до 500 000 ₽ в месяц
Внести наличные на счет 0. 09 % минимум 50 ₽ 0.09 % минимум 50 ₽ 0.09 % минимум 50 ₽ 0.09 % минимум 50 ₽ 0.09 % минимум 50 ₽
Внести наличные на счет через кассу банка 0.3 % не менее 50 ₽ 0.3 % не менее 50 ₽ 0.1 % не менее 50 ₽ от 0.07 %
  • до 100 000 ₽ — 0.1 % (не менее 50 ₽)
  • от 100 000.01 до 200 000 ₽ — 0.09 %
  • от 200 000.01 до 500 000 ₽ — 0. 08 %
  • от 500 000.01 ₽ — 0.07 %
0.07 % не менее 50 ₽
Открыть счет Открыть счет Открыть счет Открыть счет Открыть счет

Расчетно-кассовое обслуживание для бизнеса

Обслуживание всех видов банковских счетов в рублях и иностранных валютах. Услуги интернет-банкинга. Международные расчеты, валютный контроль. Аккредитивы в рублях, банковские гарантии.

Возможность получать доход юридическим лицам от остатков денежных средств…

Обслуживание всех видов банковских счетов в рублях и иностранных валютах. Услуги интернет-банкинга. Международные расчеты, валютный контроль. Аккредитивы в рублях, банковские гарантии.

Полный комплекс расчетных и кассовых услуг. Открытие и ведение счетов в рублях и иностранных валютах, расчеты по аккредитивам и инкассо, прием и выдача наличных денежных средств, оформление паспортов сделок по экспортным и импортным контрактам, проведение конверсионных операций.

Расчетно-кассовое обслуживание – это перечень услуг, которые позволяют банку обеспечить проведение расчетных операций по счету клиента.

Преимущества оформления расчетно-кассового обслуживания в Джей энд Ти Банке:

  • Персональный подход к нашим клиентам;
  • Персональный консультант при открытии счета;
  • Гарантия конфиденциальности.

Тарифы на расчетно-кассовое обслуживание

Необходимые документы для открытия счета

    Расчетные счета открываются как компаниям и предпринимателям, зарегистрированным в Российской Федерации, так и фирмам-нерезидентам. Процедура открытия счета занимает не более 3-х банковских дней с момента предоставления пакета документов.

Как оформить расчетно-кассовое обслуживание? Как открыть счет?

Для того, чтобы получить расчетный счет, Вам необходимо обратиться в офис Джей энд Ти Банка, имея с собой весь необходимый список документов, а также заполненное заявление на открытие.

После проверки и рассмотрения заявки, специалисты банка составят соответствующий договор, в котором будут указаны тарифы на услуги, реквизиты, а также перечень услуг, которыми клиент планирует пользоваться на время действия договора.

 

Более подробную информацию Вы можете получить по телефону:

Ирина Новикова: +7 495 662 45 45 – доб. 024

тарифы в Москве – открыть расчетный счет для ИП онлайн бесплатно в Почта Банке

Отсутствие изменений в идентификационных сведениях Письмо в свободной форме, с указанием информации о том, что идентификационные сведения, не менялись и являются актуальными Возможная форма предоставления
*Изменение учредительных документов, наименования организации, изменение организационноправовой формы организации, адреса местонахождения организации Учредительные документы в последней действующей редакции
Письмо в свободной форме с указанием изменений и подтверждением отсутствия иных изменений Возможная форма предоставления
Продление сроков полномочий Руководитель ЮЛ: Письмо в свободной форме с указанием изменений и подтверждением отсутствия иных изменений (при предоставлении решения/протокола о продлении полномочий, дополнительно письмо в свободной форме об отсутствии иных изменений) Возможная форма предоставления
Доверенное лицо: Нотариальная доверенность дополнительно письмо в свободной форме об отсутствии иных изменений
**Изменении состава учредителей/участников/акционеров Протокол высшего органа управления / решение единственного участника общества об изменении состава учредителей**
Учредительные документы в последней действующей редакции (в случае внесения изменений в учредительные документы)
для ООО: список участников, выданный самим обществом (за исключением сведений о персональном составе участников юридического лица, владеющих менее чем пятью процентами долей юридического лица), датирован не позднее 30 дней до даты предоставления в Банк Образец заполнения
для АО: Выписка из реестра акционеров, выданная лицом, ведущим реестр акционеров такого общества (за исключением сведений о персональном составе акционеров юридического лица, владеющих менее чем пятью процентами акций юридического лица), датирован не позднее 30 дней до даты предоставления в Банк
для НКО: Реестр участников (членов)
письмо в свободной форме с указанием изменений и подтверждением отсутствия иных изменений Возможная форма предоставления
*Изменение сведений об основном ОКВЭД письмо в свободной форме с указанием изменений и подтверждением отсутствия иных изменений Возможная форма предоставления
Иные изменения документы, подтверждающие внесение изменений
письмо в свободной форме с указанием изменений и подтверждением отсутствия иных изменений Возможная форма предоставления
***Изменение сведений о бенефициарных владельцах Клиента сведения о физическом лице — Бенефициарном владельце Клиента
Для АО: Выписка из реестра акционеров, выданная лицом, ведущим реестр акционеров такого общества (за исключением сведений о персональном составе акционеров юридического лица, владеющих менее чем пятью процентами акций юридического лица), датирован не позднее 30 дней до даты предоставления в Банк
письмо в свободной форме с указанием изменений и подтверждением отсутствия иных изменений Возможная форма предоставления
***Изменение сведений о выгодоприобретателе Клиента сведения о физическом лице — выгодоприобретателя Клиента
Анкета ЮЛ — выгодоприобретателя Клиента
Анкета ИП — выгодоприобретателя Клиента
письмо в свободной форме с указанием изменений и подтверждением отсутствия иных изменений
Смена номера телефона, адреса электронной почты документ, удостоверяющий личность Представителя Заявление, оформленное сотрудником
Изменение сведений о Представителе ЮЛ/ИП документ, удостоверяющий личность Представителя Заявление, оформленное сотрудником
Cмена Руководителя ЮЛ документ, удостоверяющий личность вновь избранного руководителя ЮЛ Заявление, оформленное сотрудником
Протокол (решение) органа управления организации, который по Уставу Клиента уполномочен назначать руководителя, об избрании / назначении на должность единоличного исполнительного органа — в случае избрания единоличного исполнительного органа коллегиальным органом организации (Совет директоров / Правление), дополнительно предоставляются документы, подтверждающие полномочия лиц, входящих в состав данного коллегиального органа, действовавших на дату избрания единоличного исполнительного органа (Протокол общего собрания)
Замена Представителя, не являющегося Руководителем ЮЛ Документ, удостоверяющий личность Представителя, действующего по доверенности Заявление, оформленное сотрудником
Нотариальная доверенность Рекомендованная форма
*Реорганизации Клиента – ЮЛ Протокол / Решение о реорганизации
Учредительные документы в последней действующей редакции (в случае внесения изменений в учредительные документы)
в случае реорганизации в форме разделения, выделения Передаточный акт
при изменении организационноправовой формы при реорганизации для ООО: список участников, выданный самим обществом (за исключением сведений о персональном составе участников юридического лица, владеющих менее чем пятью процентами долей юридического лица), датирован не позднее 30 дней до даты предоставления в Банк Образец заполнения
для АО: Выписка из реестра акционеров, выданная лицом, ведущим реестр акционеров такого общества (за исключением сведений о персональном составе акционеров юридического лица, владеющих менее чем пятью процентами акций юридического лица), датирован не позднее 30 дней до даты предоставления в Банк
для НКО: Реестр участников (членов)
при реорганизации произошло изменение сведений о бенефициарных владельцах Клиента, выгодоприобретателе Клиента Предоставляются документы согласно п. 7,8
Банкротство Клиента документ, удостоверяющий личность Арбитражного управляющего/ Конкурсного управляющего
судебный акт об утверждении Арбитражного управляющего/ Конкурсного управляющего в деле о несостоятельности (банкротстве)
Ликвидация Клиента – ЮЛ документ, удостоверяющий личность ликвидатора
протокол / решение о начале процедуры ликвидации и назначении ликвидатора

Имя Зерко Значение? Что означает Зерко

Значение имени Зерко и анализ личности. Лишь немногие знают истинную сущность своих имен. Откройте для себя скрытый смысл ваших имен. Веселый, яркий вы человек действия и общения. Вот почему вам нужно обмениваться, открывать и учиться вместе с другими.

Любопытный по своей природе человек неутолимая жажда знаний, который часто заставляет раздвигать границы и отправляться в неизведанные горизонты. Создавая свою повседневную жизнь с небольшой фантазией, вы особенно креативны и интуитивны.

Итог?

Общительный экстраверт, всегда заводящий новых друзей. Оптимистичный человек, который видит хорошие стороны вещей и принимает жизнь такой, какая она есть, что позволяет вам в полной мере использовать ее. Адаптируясь ко всем новым ситуациям, вы быстро знакомитесь с людьми.
Однако обратите внимание на то, чтобы не скатиться к поверхностности из-за потребности нравиться, чтобы на вас смотрели и слушали. Рождение под числом обмена означает, что вы ненавидите конфликты или противоречия, предпочитая бежать, а не противостоять им.

Зерко означает связанный с работой

Работа для вас означает отношения, контакт или движение.

Итак, существует потребность в контакте с другими, в увлекательных и обогащающих встречах, чтобы разнообразить удовольствия или дисциплины. Обладая хорошим чувством общения, вы созданы для работы в команде. Обладая сильными дипломатическими способностями, вы успешно реализуете свои проекты или идеи. Разносторонний, вы можете выполнять ряд сделок и выполнять различные задачи, прекрасно адаптируясь.

Подходящие профессии: коммуникативные навыки (человеческие ресурсы, реклама, ответственный за коммуникацию), аудиовизуальные (телевидение, радио) профессии, художественная деятельность (модератор, художник, танцор, креатив, дизайнер), торговля (все формы), туризм , торговая деятельность, издательское дело, журналистика, астрология, психология, нумерология.

Что значит хорошее самочувствие для Зерко?

Вы активный человек, которому нужно жить полноценно, независимо от денежных затрат.

Таким образом вы часто ставите сто процентов.Если вы задаете вопросы, они редко бывают экзистенциальными, потому что вы позволяете себе увлечься жизнью, всегда откусывая по кусочку за раз. Ваши слабые места: руки, легкие, гортань, нервная система, желудок.

Зерко означает на финансовом уровне

Ваши отношения с деньгами сложны, потому что вы видите в них инструмент, который помогает вам реализовать и осуществить свои мечты.

В основном вы будете жить согласно своим желаниям, но это чередуется с периодами бережливости!

Зерко Значение, произношение, происхождение и нумерология

Нумерология имени Зерко — 3 , и здесь вы можете узнать, как произносится Зерко, происхождение имени Зерко, нумерология и имена, похожие на Зерко.

Как произносится Zerko?

Голосовое произношение:

Щелкните и прослушайте аудио произношение несколько раз и узнайте, как произносится имя Зерко. Если вы чувствуете, что произношение должно быть лучше, запишите произношение своим голосом и помогите другим.

Запишите произношение своим голосом

Запись произношения

Примечание: попробуйте записать произношение в течение 3 секунд.

Начать запись

00:00

Мы продолжаем добавлять значения и другую информацию ко всем именам. Так что продолжайте посещать снова, чтобы узнать значение этого имени и другую информацию.

«Поиск заканчивается при запуске совместного использования»

Если вы уже знаете значение Zerko на английском или на любом другом языке, пожалуйста, поделитесь этим, это будет полезно для других пользователей, также вы можете редактировать любые данные, такие как пол, произношение и происхождение, для повышения точности.

Имя Зерко Нумерология

Нумерология (Число выражений) 3
Число желаний сердца 11
Число личности 1
Анализ талантов
Зерко по выражению number 3

«Вы оптимистичны, вдохновляете, общительны и экспрессивны. Люди видят вас веселым, позитивным и обаятельным; ваша личность обладает определенной энергией и энергией, которая настолько сильно влияет на других, что вы можете вдохновлять людей без усилий.Вся эта восходящая энергия — симптом вашего огромного творчества. Ваши словесные навыки могут привести вас в области письма, комедии, театра и музыки ».

Внутренний анализ
Зерко наизусть номер 11

«У вас мудрость не по годам. Даже в детстве вы хорошо понимали жизнь, хотя, скорее всего, это не осознавали другие. Вы прирожденный миротворец. Вами движет желание разрешать конфликты и создавать гармонию.Вы целитель и провидец. Вы жаждете сделать мир лучше и не можете успокоиться, пока не посвятите свою жизнь какому-нибудь достойному делу ».

Анализ личности
Зерко по номеру личности 1

«Вы излучаете динамичную и эффективную энергию. Вы кажетесь управляемым и способным. Вы цените смелость и усилия перед лицом трудностей, и эти качества проявляются. Другие могут почувствовать, что вас не будут толкать. Одевайтесь достойно и правильно, заботясь о деталях своей внешности.Хотя вы можете проводить большую часть своего времени в строгом деловом платье или костюмах, яркие и жизнерадостные цвета вам подходят ».

Чтобы получить более подробные сведения о числовой нумерации в зависимости от даты вашего рождения, посетите наш нумерологический калькулятор.

Аббревиатура Зерко

Z Zest
E Eminent
R Надежный
K Kalon
O Открыто

Не является аббревиатурой. хорошо? Создавайте новые!

Зерко Именной плакат

Поделитесь этой страницей с хэштегом #MeaningOfMyName и предложите друзьям поделиться своим значением имени.

Зерко — Модные стили текста

Вы можете использовать эти причудливые тексты для имени вашего профиля, статусов, сообщений в большинстве социальных сетей, таких как WhatsApp, Twitter, Facebook, Instagram и других.

💤🎗🌱🎋⚽
Ⓩⓔⓡⓚⓞ
zǝɹʞo
ℤ𝕖𝕣𝕜𝕠
🆉🅴🆁🅺🅾
Z ♥ E ♥ R ♥ K ♥ O ♥
҉Z҉҉E҉҉R҉҉K҉҉O҉
乙 乇 尺 Ҝ ㄖ

Как и выше, 30+ модных текстовых стилей доступны для имени « Zerko » в нашем Генераторе необычных текстов.Пойдите и проверьте все стили, чтобы получить больше удовольствия!

Популярные люди и знаменитости на имя Зерко

На данный момент народов не найдено! Ваше имя — Зерко или Если вы знаете людей по имени Зерко, добавьте его в список. Добавить людей на имя Зерко


Комментарии пользователей о Зерко
  • Комментариев пока нет. Оставьте первый комментарий.
Вы можете заинтересовать

Имена, похожие на Zerko

Нужна помощь или отзывы? Сообщите нам

Мавиор против Зерко Лтд — Судебная практика

Денхэм К.J.

Кларк Дж.

MacMenamin J.

2

1.1 Вопрос о том, что истцы или заявители должны предоставить обеспечение судебных издержек или апелляций, всегда вызывал сложные вопросы. Однако в тяжелые финансовые времена таким вопросам уделяется гораздо больше внимания.На таком фоне стороны по понятным причинам обеспокоены участием в дорогостоящих судебных тяжбах только для того, чтобы обнаружить, что, несмотря на успех в рассматриваемом судебном разбирательстве, их оппонент не в состоянии покрыть компенсацию расходов, которые обычно следовали бы. С другой стороны, истцы и апеллянты по понятным причинам обеспокоены тем, что их обычное право возбуждать и возбуждать судебное разбирательство или обжаловать неблагоприятные решения может быть существенно ограничено, если от них потребуют внести значительные суммы денег в качестве платы за судебное разбирательство.

3

1.2 Этот суд недавно, в деле Фаррелл против Банка Ирландии [2012] IESC 42, должен был рассмотреть юрисдикцию для присуждения обеспечения для покрытия расходов на апелляцию. Решение по этому делу также предоставляет некоторый анализ общих принципов со ссылкой на то, какие меры безопасности могут быть заказаны. Однако, как указано в Farrell, , по крайней мере, в некоторых отношениях применяются разные соображения в отношении обеспечения расходов по еще неурегулированному иску, с одной стороны, и апелляции против неблагоприятного заключения, с другой стороны.Точно так же существуют различия между обеспечением, предоставленным компаниям с ограниченной ответственностью, с одной стороны, и физическим лицам, с другой.

4

1.3 Действительно, в основе этой апелляции лежит позиция юридического лица (хотя и не компании с ограниченной ответственностью). Истец / ответчик («Мавиор») — зарегистрированная в Ирландии компания с неограниченной ответственностью. Он возбуждает это судебное разбирательство с требованием денежных сумм, которые, как утверждалось, причитаются с ответчика / истца («Зерко») либо на основании контракта, либо на основе квоты квантовых мер , возникающих в результате строительных работ, связанных с существенным ремонтом, который должен быть перенесено в здание отеля в Дублине, поврежденное штормом.Зерко категорически возражает против этих требований. Действительно, Зерко заходит так далеко, что заявляет, что у него нет договорных или юридических отношений с Мавиором, которые позволили бы Мавиору поддерживать какие-либо претензии к нему. В этих обстоятельствах Зерко требовал обеспечения расходов на судебное разбирательство против Мавиора. Дело было передано в Высокий суд (Finlay Geoghegan J. ) и стало предметом постановления от 22 и ноября 2012 г. ( Mavior v. Zerko Limited [2012] IEHC 471). Вынося это суждение, Финли Геогеган Дж.отклонил ходатайство Зерко о возмещении расходов. Зерко обжаловал этот отказ в этом суде. Уместно начать с краткого изложения соответствующих исходных фактов.

2

2.1 В обстоятельствах, которые не являются существенными для узкого вопроса, который сейчас должен рассмотреть этот Суд, Zerko, который, по всей видимости, является специализированной структурой, учрежденной Ulster Bank Ireland Limited для целей владения долей участия в банковском синдикате в Ballsbridge Inns и Tower Hotels в Дублине заключили соглашение с MJBCH Limited в целях управления этими отелями.MJBCH Limited — компания, контролируемая господином Шоном Данном. Между MJBCH Limited и Mavior существует связь, поскольку, по-видимому, принято считать, что вся бенефициарная доля в Mavior в конечном итоге принадлежит г-же Гейл Киллилеа. Мисс Киллилея замужем за мистером Шоном Данном.

3

2.2 Утверждается, что в результате урагана было заключено соглашение между Zerko и MJBCH Limited о том, что последняя организует ремонт и восстановительные работы, которые будут выполнены.Также утверждается, что MJBCH заключила соглашение с Mavior на выполнение некоторых из соответствующих работ. Утверждается, что MJBCH имел полномочия, как агент Зерко, заключать соглашение с Mavior и, следовательно, Zerko несет ответственность перед Mavior по оплате в соответствии с этим контрактом. В качестве альтернативы, как уже указывалось, Mavior требует денег, которые, как утверждалось, причитались ему Зерко на основе квантового эквивалента в счет стоимости таких строительных работ, которые, как утверждается, были выполнены по запросу Зерко и с ведома Зерко.

4

2.3 Zerko оспаривает условия предполагаемого соглашения между ним и MJBCH Limited, а также наличие какого-либо контракта между ним и Mavior. Хотя Зерко не оспаривает, что Мавиор выполнял работы в отелях, от которых он теперь получает прибыль, Зерко утверждает, что некоторые из работ не соответствовали стандартам. Зерко также говорит, что договоренности между …

Комбинация TRAIL длительного действия и фотодинамической терапии, нацеленной на опухолевые клетки, как новая стратегия преодоления химиотерапевтической множественной лекарственной устойчивости и TRAIL-резистентности колоректального рака

Резюме

Химиотерапевтическая множественная лекарственная устойчивость (МЛУ) является основным препятствием для клинической терапии колоректального рака (CRC).Лиганд, индуцирующий апоптоз, связанный с фактором некроза опухоли (TRAIL), обладающий избирательной цитотоксичностью, может преодолевать МЛУ клеток CRC. К сожалению, перекрестная резистентность к TRAIL была обнаружена во многих клетках CRC, что указывает на необходимость комбинирования TRAIL с сенсибилизаторами для борьбы с рефрактерным CRC. Наша цель — изучить потенциал комбинированной терапии TRAIL и направленной на опухолевые клетки фотодинамической терапии (PDT) в борьбе с CRC с химиотерапевтическим MDR и резистентностью к TRAIL.

Методы: ФДТ, нацеленная на опухолевые клетки, выполнялась с использованием фотосенсибилизатора Ze-IR700 с высоким сродством к рецептору эпидермального фактора роста (EGFR).Влияние ФДТ на экспрессию генов клеток CRC было выявлено путем секвенирования РНК. Синергетический противоопухолевый эффект TRAIL и PDT длительного действия был оценен на мышах, несущих опухолевые трансплантаты клеток CRC с химиотерапевтической устойчивостью к MDR и TRAIL.

Результаты: Химиотерапевтическая резистентность к МЛУ и TRAIL является обычным явлением для клеток CRC. Предварительная обработка клеток CRC ФДТ, нацеленной на опухолевые клетки, значительно (в 10-60 раз) увеличивала чувствительность этих клеток CRC к TRAIL за счет активации рецепторов смерти.Комбинированная терапия, но не монотерапия, TRAIL и PDT длительного действия в значительной степени индуцировала апоптоз клеток CRC, таким образом, эффективно уничтожая большие (~ 150 мм 3 ) ксенотрансплантаты опухоли CRC у мышей.

Выводы: ФДТ, нацеленная на опухолевые клетки, сильно сенсибилизирует клетки CRC к TRAIL. Комбинированная терапия TRAIL длительного действия и ФДТ является многообещающей для борьбы с CRC как с химиотерапевтической МЛУ, так и с резистентностью к TRAIL, что может быть разработано как новая стратегия точной терапии рефрактерной CRC.

Ключевые слова: Лиганд, индуцирующий апоптоз, связанный с фактором некроза опухоли, фотодинамическая терапия, множественная лекарственная устойчивость, таргетная терапия рака, колоректальный рак.

Введение

Колоректальный рак (CRC) является одним из наиболее распространенных видов рака и занимает второе место среди причин смерти от рака в мире в 2019 году 1 . Обычная химиотерапия была основной адъювантной терапевтической стратегией при CRC в последние десятилетия. Недавно были идентифицированы многочисленные химические вещества, нацеленные на сигнальные пути, опосредованные рецептором эпидермального фактора роста (EGFR) или рецептором фактора роста эндотелия сосудов (VEGFR), что обеспечивает новые альтернативы терапии CRC 2 . Однако белки химического оттока, , т.е. , переносчики АТФ-связывающей кассеты (ABC), повсеместно экспрессируются в энтероцитах 3 , 4 , что облегчает выработку клетками CRC химиотерапевтической множественной лекарственной устойчивости (MDR). ) как для обычных химиотерапевтических средств, так и для новых химикатов молекулярного таргетинга 5 . Из-за различий в механизмах проникновения и действия в клетки макромолекулярные белки, такие как моноклональные антитела против EGFR, могут обходить путь МЛУ для небольших химических препаратов.Однако гетерогенные мутации в генах, таких как KRAS, NRAS и BRAF, вызывают устойчивость CRC к лечению анти-EGFR 6 . Несмотря на быстрый прогресс терапевтических стратегий, перспективы заболеваемости CRC мрачны. Количество новых случаев CRC составило примерно 1,8 миллиона в 2018 году, но глобальное бремя CRC может увеличиться до 60% к 2030 году 1 . Очевидно, что для точной терапии CRC с химиотерапевтическим МЛУ срочно требуются инновационные терапевтические стратегии.

Апоптоз — важный механизм гемеостаза. Лиганд, индуцирующий апоптоз, связанный с фактором некроза опухоли (TRAIL), мощный индуктор апоптоза, отображаемый на поверхности NK-клеток и цитотоксических Т-клеток, играет важную роль в защите опухоли 7 . Рекомбинантный растворимый TRAIL является привлекательным в качестве противоопухолевого агента из-за его селективной индукции апоптоза в опухолевых клетках, сверхэкспрессирующих рецепторы TRAIL (рецептор смерти 4, DR4 и рецептор смерти 5, DR5) без системной токсичности.Хотя MDR является обычным явлением для CRC, рекомбинантный TRAIL проявляет сильную цитотоксичность в многочисленных клетках CRC 8 , что предполагает потенциал TRAIL для преодоления MDR CRC. Однако противоопухолевый эффект in vivo TRAIL далек от удовлетворительного, что в основном объяснялось ограниченным поглощением опухолью в результате плохого нацеливания на опухоль, а также коротким периодом полужизни TRAIL 9 в сыворотке. В последние годы были предприняты большие усилия для улучшения фармакокинетики TRAIL 10 13 , что значительно усилило противоопухолевый эффект TRAIL в отношении различных раковых клеток.Однако многие клетки CRC все еще устойчивы к этим модифицированным форматам TRAIL 8 , что указывает на необходимость комбинации TRAIL с сенсибилизатором опухолевых клеток для преодоления химиотерапевтической устойчивости к MDR и TRAIL. Фактически, предварительная обработка некоторыми химическими препаратами определенно сенсибилизировала клетки CRC к TRAIL за счет активации рецепторов смерти и / или подавления антиапоптотических белков 14 , 15 . Однако комбинация TRAIL и химиотерапевтических средств не показала многообещающего синергетического противоопухолевого эффекта у пациентов с CRC 16 .С одной стороны, большинство химических веществ в сочетании с TRAIL неспецифически токсичны для клеток. Чтобы избежать системной токсичности, эти неспецифические химические вещества следует вводить в низких дозах, которые не могут эффективно сенсибилизировать опухолевые клетки. С другой стороны, фармакокинетика TRAIL и небольших химических веществ определенно различается. Поскольку химические вещества требуют много времени для индукции экспрессии рецептора смерти в опухолевых клетках, короткий период полужизни в сыворотке ограничивает TRAIL уничтожением опухолевых клеток, предварительно сенсибилизированных химическими веществами.Следовательно, комбинация TRAIL длительного действия и терапевтического средства, которое будет избирательно действовать на опухолевые клетки, может оказывать многообещающий синергетический противоопухолевый эффект без системной токсичности.

Интересно, что было обнаружено, что избыточные активные формы кислорода (АФК) могут сенсибилизировать клетки CRC к TRAIL за счет активации рецепторов смерти и / или подавления антиапоптотических белков 17 . Фотодинамическая терапия (ФДТ) эффективна в производстве АФК путем активации фотосенсибилизатора в клетках с помощью лазерного света 18 , 19 . Фактически, предварительные исследования показали, что PDT индуцирует экспрессию рецептора смерти в некоторых раковых клетках, продуцируя ROS 20 , 21 , что позволяет предположить, что PDT может синергетически взаимодействовать с TRAIL в уничтожении клеток CRC с химиотерапевтической MDR и резистентностью к TRAIL. Кроме того, из-за задействованных уникальных механизмов, включая индукцию апоптоза, а также повреждение транспортеров ABC, ФДТ считалась потенциальной стратегией преодоления МЛУ рака 22 , 23 .Примечательно, что PDT достигается за счет запуска поглощения фотосенсибилизатора клетками с использованием лазерного света с определенной длиной волны. Из-за короткого срока жизни и ограниченного расстояния диффузии ROS фототоксичность, вызванная PDT, была ограничена клетками, поглощающими фотосенсибилизаторы, и облученными лазерным светом. После того, как фотосенсибилизаторы были конъюгированы с носителем, возвращающим опухоль, фототоксичность ФДТ может быть дополнительно сфокусирована на опухолевых клетках 24 , что способствует точности и биобезопасности ФДТ в терапии рака. Фактически, PDT была одобрена для лечения различных солидных опухолей, включая CRC 25 . Потенциальный синергизм между PDT и TRAIL в уничтожении клеток CRC и клиническая биобезопасность как PDT, так и TRAIL сильно вызвали наш интерес к оценке эффекта их комбинации в борьбе с CRC с химиотерапевтической MDR и TRAIL-устойчивостью.

Поскольку рецептор эпидермального фактора роста (EGFR) сверхэкспрессируется в большинстве клеток CRC с MDR, мы попытались провести ФДТ, нацеленную на опухолевые клетки, путем доставки фотосенсибилизаторов в клетки CRC с использованием аффибоди Z EGFR , которое имеет высокую специфичность и сродство к EGFR 26 , 27 .Впоследствии мы определили молекулярную основу синергизма между PDT, нацеленной на опухолевые клетки, и TRAIL в уничтожении клеток CRC. Наконец, мы исследовали синергетический противоопухолевый эффект ФДТ, нацеленной на опухолевые клетки, и варианта TRAIL длительного действия, , т. е. , IgBD-TRAIL, который мог связывать эндогенный IgG 28 у мышей, несущих опухолевые трансплантаты клеток CRC с химиотерапевтическим MDR и TRAIL сопротивление. Наши результаты показали, что ФДТ, нацеленная на опухолевые клетки, сильно сенсибилизировала клетки CRC с множественной лекарственной устойчивостью к TRAIL, активируя как DR4, так и DR5.Кроме того, комбинация IgBD-TRAIL длительного действия, но не TRAIL с коротким периодом полувыведения из сыворотки, и ФДТ, нацеленная на опухолевые клетки, эффективно уничтожала большие (~ 150 мм 3 ) опухолевые трансплантаты клеток CRC с химиотерапевтическим МЛУ и TRAIL. резистентность, предполагая, что комбинированная терапия TRAIL длительного действия и ФДТ, нацеленная на опухолевые клетки, может быть новой стратегией для борьбы с рефрактерным CRC.

Материалы и методы

Получение и характеристика аффибоди Ze

Ген, кодирующий аффибоди Z EGFR , был разработан в соответствии с аминокислотной последовательностью Z EGFR : 1907 (обозначенной в этой статье как Ze) 26 . Дополнительную метку (HE) 3 и остаток Cys добавляли к N- и C-концам аффитела Ze соответственно. Ген был оптимизирован для экспрессии в E. coli и синтезирован компанией Convenience Biology (Чанчжоу, Китай). Экспрессионная плазмида pQE30-Ze была сконструирована путем вставки гена, кодирующего аффибоди Ze, в pQE30. Для получения аффибоди Ze, pQE30-Ze трансформировали в E. coli M15 и индуцировали добавлением изопропил-β-D-тиогалактозида (IPTG, 0.1 мМ) при 24 ° C в течение ночи. После сбора клеток центрифугированием при 7000 g в течение 10 мин их ресуспендировали в связывающем буфере (50 мМ фосфат, pH 8,0; 300 мМ NaCl; 5 мМ имидазол, 1 мМ фенилметилсульфонилфторид) с последующим пропусканием через гомогенизатор высокого давления. (50-80 МПа) 3-4 раза. Аффитела Ze в супернатанте были связаны со смолой Ni-NTA super flow (Qiagen, CA) и элюировались с использованием элюирующего буфера (50 мМ фосфат, pH 8,0; 300 мМ NaCl, 300 мМ имидазол). Очищенные аффитела Ze подвергали диализу против фосфатно-солевого буфера (PBS, 10 мМ Na 2 HPO 4 , 2 мМ KH 2 PO 4 , 137 мМ NaCl, 2. 68 мМ KCl, pH 7,4) в течение ночи с последующим хранением при -70 ° C до дальнейшего использования.

Электрофорез в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (SDS-PAGE) и эксклюзионная хроматография (SEC) были использованы для определения чистоты и молекулярной массы Ze affibody 29 . Для измерения аффинности аффинного тела Ze к EGFR внеклеточный домен EGFR, слитый с Fc IgG1 (Sino Biological, Пекин, Китай), иммобилизовали на покрытых протеином А зондах с последующей вставкой зонда в растворы, содержащие различные концентрации. Зе affibody.Последующую интерферометрию биослоя проводили на платформе Octet® (Pall ForteBio LLC, CA), как описано Yang et al. 28 .

Получение и характеристика белков TRAIL

IgBD-TRAIL и TRAIL были получены и охарактеризованы в соответствии с нашими предыдущими работами 28 . IgBD-TRAIL продуцировали путем генетического слияния IgG-связывающего домена (IgBD) с N-концом TRAIL. Чтобы исследовать связывание IgG с помощью SEC, IgBD-TRAIL смешивали с мышиным IgG (mIgG) в молярном соотношении 1: 1 с последующей инкубацией при комнатной температуре в течение 0. За 5 ч до загрузки в колонку для SEC. Образование нового белкового комплекса большего размера, чем отдельные mIgG и IgBD-TRAIL в смеси, отражает связывание IgBD-TRAIL с mIgG. Разница в периоде полужизни в сыворотке между IgBD-TRAIL и TRAIL была проиллюстрирована путем измерения зависящего от времени снижения цитотоксичности остаточных белков TRAIL в крови. Снижение скорости цитотоксичности отражает скорость выведения этих белков TRAIL из крови.

Поглощение опухолью и тканевое распределение белка

Для маркировки белка 5 (6) -карбоксифлуоресцеин (FAM) или CF TM 750 сукцинимидиловый эфир (CF750) (Sigma, MA) конъюгировали с белками Ze affibody или TRAIL. согласно методам, описанным Shi et al. 29 . Вкратце, pH раствора, содержащего 1,5 мг / мл белка, сначала доводили до 8,0 добавлением 1 М NaHCO 3 . Затем флуоресцентный краситель, растворенный в диметилсульфоксиде (ДМСО), добавляли к раствору белка в надлежащем молярном соотношении (белок 1:20 к FAM; белок 1: 6 к CF750) с последующей инкубацией при комнатной температуре в течение 1 часа в темноте. Свободный краситель исключили диализом смеси против PBS в течение ночи с многократной заменой буфера.

Для определения распределения в тканях с помощью оптической визуализации белки, меченные CF750 (3 мг / кг для Ze и 5 мг / кг для белков TRAIL), внутривенно вводили мышам, несущим подкожные трансплантаты опухоли. Опухоли и некоторые важные органы / ткани были собраны и сканированы с использованием оптической системы визуализации IVIS (Caliper Life Sciences, Калифорния) через 4 часа. Для дальнейшего изучения клеточного распределения Ze affibody мышам внутривенно вводили FAM-меченное Ze affibody. Опухолевые трансплантаты собирали и разрезали в замороженных условиях через 4 часа после инъекции.Опухолевые клетки указывали с помощью иммунофлуоресценции с кроличьими антителами против EGFR человека перед наблюдением под флуоресцентным микроскопом. Совместная локализация FAM-меченного аффибоди Ze с EGFR выявляет распределение аффибоди Ze на опухолевых клетках.

Чтобы исследовать влияние ФДТ на поглощение белков TRAIL опухолью, мышам, несущим опухолевые трансплантаты, внутривенно вводили равные молекулярные количества FAM-меченых IgBD-TRAIL или TRAIL с последующей ФДТ. Через час трансплантаты опухоли собирали и делали срезы в замороженных условиях.Клетки в опухолевых тканях визуализировали окрашиванием DAPI перед наблюдением под многофотонным лазерным конфокальным микроскопом (Nikon, Токио, Япония). Сравнивали поглощение белков опухолевыми трансплантатами, обработанными с ФДТ или без нее.

Конъюгирование фотосенсибилизатора с Ze affibody

Фотосенсибилизатор IRDye ® 700DX сложный эфир N-гидроксисукцинимида (IR700, LI-COR Biosciences, Lincoln, NE) был конъюгирован с Ze affibody согласно описанному методу Ze-IR700. Автор: Mitsunaga et al. 24 с некоторыми модификациями. Вкратце, Ze affibody разбавляли PBS до 1,5 мг / мл с последующим доведением pH раствора белка до 8,5 добавлением 1 M Na 2 HPO 3. Затем растворимый IR700 смешивали с белком. при молярном соотношении 1: 2 (белок к IR700) и инкубировали при комнатной температуре в течение 1 ч в темноте. Для удаления неконъюгированного красителя IR700 смесь диализовали против PBS в течение ночи с многократной заменой буфера. Для подтверждения конъюгации IR700 с аффителом Ze диализованную смесь подвергали электрофорезу на геле SDS-PAGE и сканировали с помощью двухцветной инфракрасной системы визуализации LI-COR Odyssey CLx Imager (Lincoln, NE).

Клеточная культура и анализ цитотоксичности

Клетки

CRC, включая COLO205, COLO 320 DR, COLO 320 HSR, LS174T, HT29, HCT-8, LOVO, RKO, LS180, T84 и HCT116, были приобретены у американской типовой культуры. Сбор (ATCC, VA, USA) и культивирование в соответствии с руководством, предоставленным поставщиком. Генотипирование этих клеток с помощью коротких тандемных повторов (STR) было выполнено Feiouer Inc. (Чэнду, Китай).

Для измерения цитотоксичности белков TRAIL в клетках CRC, предварительно обработанных Ze-IR700-опосредованной PDT, клетки CRC (1-2 × 10 4 клеток / лунка) высевали в 96-луночный планшет с прозрачным дном и черным дном (Thermo, CA ) инкубировали с 0.5-2 мкМ Ze-IR700 при 37 ° C в течение 0,5 ч перед облучением. После PDT к клеткам добавляли возрастающие концентрации IgBD-TRAIL или TRAIL с последующей инкубацией в течение ночи. Выжившие клетки измеряли с использованием раствора CCK-8 (Dojindo, Япония) в соответствии с описаниями Yang et al. 28 . По сравнению с цитотоксичностью белков TRAIL в клетках CRC без обработки PDT, увеличение цитотоксичности TRAIL в клетках CRC, обработанных PDT, отражает синергию между белками TRAIL и опосредованной Ze-IR700 PDT.Для определения зависимости синергизма от рецептора смерти растворимый рецептор смерти, включая DR4-Fc и DR5-Fc (Sino Biological Inc, Пекин, Китай), добавляли в клетки, обработанные PDT, перед добавлением белков TRAIL.

Для исследования цитотоксичности химических препаратов клетки CRC обрабатывали цисплатином, винкристином, доксорубицином или бортезомибом (Селлек, Техас) в различных концентрациях (0–5000 нМ) в течение ночи с последующим измерением выживших клеток с помощью CCK8.

Для расчета выживаемости жизнеспособность обработанных PBS клеток считалась 100%.

In vitro PDT

Ze-IR700-опосредованная PDT в клетках CRC выполнялась согласно описанию Shi et al. 29 с небольшими изменениями. Вкратце, клетки (1 × 10 4 клеток / лунку) высевали в 96-луночный планшет с прозрачным дном и черным дном и инкубировали в течение ночи. Ze-IR700 (4 мкМ) добавляли в клетки и дополнительно инкубировали в течение 0,5 ч при 37 ° C. После двух промывок DMEM с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) клетки облучали лазером с плотностью потока энергии 16 мВт / см 2 для получения общей дозы 10 Дж / см 2 при 690 нм .Выжившие клетки измеряли на следующий день с помощью CCK-8. Для визуализации живых и мертвых клеток приблизительно 2 × 10 4 клеток инокулировали в 96-луночный планшет и обрабатывали PDT. SYTO 9 (указывает на живые клетки) и йодид пропидия (PI, указывает на мертвые клетки) добавляли к клеткам в соответствии с инструкциями набора Live / Dead BacLight Bacterial Viability Kit (Invitrogen, CA) через 1 час после PDT. Чтобы проверить роль Ze в качестве носителя для IR700, аффибоди Ze в Ze-IR700 было разрушено расщеплением Ze-IR700 трипсином. Ze-IR700, расщепленный трипсином (Ze-IR700-TN), использовали в качестве контроля в некоторых экспериментах.

Чтобы определить органеллу-мишень для Ze-IR700-опосредованной PDT в клетках CRC, накопление Ze-IR700 в митохондриях и лизосомах наблюдали под многофотонным лазерным конфокальным микроскопом. Клетки (2 × 10 5 клеток в 300 мкл среды) инкубировали со смесью Ze-IR700 (5 мкМ), трекера органелл (MitoTracker для митохондрий, LysoTracker для лизосом; 200 нМ; Thermo, MA) и Hoechst ( указывающие ядра) при 37 ° C для 0.5 ч. Для определения участия АФК в Ze-IR700-опосредованной ФДТ для обнаружения АФК в облученных клетках использовали диацетат дихлородигидрофлуоресцеина (DCFH, Beyotime, Шанхай, Китай) и датчик синглетного кислорода (SOSG, Invitrogen, Карлсбад, Калифорния) описания Shi et al. 29 . Ze-IR700, расщепленный трипсином (Ze-IR700-TN), использовали в качестве контроля для Ze-IR700.

Для определения экспрессии DR4 и DR5 в клетках CRC методом проточной цитометрии 4 × 10 5 клеток (в 100 мкл среды) инкубировали с 10 мкМ (для LS174T) или 5 мкМ (для HT29) Ze-IR700 в пробирка Эппендорфа при 37 ° C для 0. 5 ч. После двух промывок PBS клетки переносили в 48-луночный планшет и облучали при 690 нм до общей дозы 10 Дж / см 2 . Затем эти клетки инкубировали с первичными антителами против DR4 или DR5 в течение 1 часа с последующей инкубацией с соответствующими вторичными антителами в течение 0,5 часа перед анализом проточной цитометрии. Клетки, обработанные без ФДТ, использовали в качестве контроля.

Для исследования влияния ФДТ, опосредованного Ze-IR700, на экспрессию генов клеток CRC путем секвенирования РНК, 5 × 10 5 клеток инкубировали с 1 мкМ Ze-IR700 в пробирке Эппендорфа, содержащей 500 мкл среды при 37 ° С. ° C для 0.5 ч. После двух промывок PBS клетки переносили в 48-луночный планшет для облучения (690 нм, 10 Дж / см 2 ). Эти клетки собирали через 1 или 24 часа после облучения для экстракции общей РНК с использованием TRIzol regent в соответствии с руководством. Секвенирование РНК было выполнено Beijing Genomics Institution (Шэньчжэнь, Китай). Клетки, не подвергнутые обработке PDT, использовали в качестве контроля.

Проточная цитометрия и иммунофлуоресценция

Уровни экспрессии EGFR, DR4, DR5, CD31 и индуцируемого гипоксией фактора-1α (HIF1α), расщепленной каспазы 3, расщепленного PARP и Ki67 исследовали с помощью проточной цитометрии или иммунофлуоресценции с первичными антителами и соответствующие им вторичные антитела.Первичные антитела включают кроличьи антитела против EGFR человека, DR4, DR5, HIF1α (Abcam, MN), Ki67 (Invitrogen, CA), расщепленную PARP или расщепленную каспазу 3 (ZEN Bioscience, Chengdu, Китай) и крысиные антитела против CD31 мыши. (БиоЛедженд, Калифорния). Вторичные антитела, полученные от ослов или коз, были помечены DyLight 550 или DyLight 488 (Abcam, MN). Первичные антитела инкубировали с опухолевыми клетками или опухолевыми тканями при комнатной температуре в течение 1,5 часов перед инкубацией со вторичным антителом в течение дополнительных 0,5 часа.

Для определения связывания белка 3 × 10 5 клеток инкубировали с 200 нМ FAM- или 4 мкМ IR700-меченным Ze affibody при 4 ° C в течение 1 ч перед анализом на проточном цитометре (Cytomics FC500, Beckman , Калифорния). Все данные были проанализированы с помощью программного обеспечения FLOWJO.

Вестерн-блоттинг

Для измерения регуляции рецепторов смерти (DR4 и DR5) и рецепторов-ловушек (DcR1 и DcR2) с помощью PDT, 4 × 10 5 клеток LS174T инкубировали с Ze-IR700 (2 мкМ) при 37 °. C для 0.5 ч с последующим облучением. Чтобы изучить подавление рецепторов смерти с помощью миРНК, 6 × 10 4 клеток HCT116 инкубировали с 75 нМ миРНК, специфичной для DR4 (siDR4, 5′-CCACAAAGAAUCAGGCAAU-3 ‘) или DR5 (siDR5, 5′-CAGCCGUAGGUCUUGA ) в течение 48 ч в 24-луночном планшете. Нерелевантную миРНК (siNC, 5’-UUCUCCGAACGUGUCACGU-3 ‘) использовали в качестве отрицательного контроля. Мембранные белки клеток экстрагировали с использованием буфера для лизиса RIPA (Beyotime, Шанхай, Китай) для SDS-PAGE. Вестерн-блоттинг выполняли с кроличьими антителами против DR4, DR5, DcR1 (Abcam, MN), расщепленным PARP, расщепленной каспазой-3, каспазой-9 (ZEN Bioscience, Чэнду, Китай) и мышиными антителами против человеческого белка, расщепленными каспазой-8. (Технология сотовой сигнализации, Массачусетс).Для устранения ROS перед ФДТ в клетки добавляли 4 мМ антиоксиданта ацетилцистеина (NAC) (Selleck Chemicals, TX).

Животная модель трансплантата опухоли и лечение

Были соблюдены все применимые институциональные руководящие принципы по уходу и использованию животных. Клетки CRC (2 × 10 6 клеток для COLO 205 и LS174T, 5 × 10 6 клеток для HT29, в 100 мкл PBS) вводили подкожно в правые задние лапы самки BALB в возрасте от 4 до 6 недель. / c голые мыши. Измеряли продольный (L) и поперечный (W) диаметры опухолевых трансплантатов и рассчитывали объем опухоли (V) по формуле: V = L × W × W / 2.Мышей, несущих опухолевые трансплантаты, лечили белками TRAIL или опосредованной Ze-IR700 PDT в качестве монотерапии или комбинированной терапии. После лечения объем опухоли измеряли каждый день. Когда объем опухоли достигал 1000 мм 3 , мышей умерщвляли. В некоторых экспериментах для мониторинга роста опухоли с помощью оптической визуализации модели животных с трансплантатом опухоли конструировали путем подкожной инъекции клеток CRC, экспрессирующих красный флуоресцентный белок (RFP) (производства Ji Manchu Biotechnology, Шанхай, Китай).

Для оценки противоопухолевого эффекта белков TRAIL в качестве монотерапии мышам, несущим опухолевые трансплантаты, внутривенно вводили однократную дозу IgBD-TRAIL (3 мг / кг для COLO 205, 10 мг / кг для LS174T и HT 29) или TRAIL. (10 мг / кг). PBS использовали в качестве контроля.

Для оценки противоопухолевого эффекта Ze-IR700-опосредованной PDT в качестве монотерапии мышам, несущим опухолевые трансплантаты, внутривенно вводили Ze-IR700 (1 или 3 мг / кг). Облучение (интенсивность потока 100 мВт / см 2 для общей дозы 60 Дж / см 2 ) проводили через 4 часа после инъекции Ze-IR700.Мышам контрольной группы вводили такой же объем PBS. Чтобы изучить повреждение ткани, опосредованное PDT, трансплантаты опухоли собирали в разное время после PDT, и гистологию опухолевых тканей исследовали с помощью окрашивания H&E.

Для оценки противоопухолевого эффекта комбинированной терапии белками TRAIL и ФДТ, опосредованной Ze-IR700, мышам внутривенно вводили 1 мг / кг Ze-IR700. IgBD-TRAIL или TRAIL (3 мг / кг) вводили внутривенно мышам непосредственно перед облучением (скорость потока 100 мВт / см 2 для общей дозы 60 Дж / см 2 ) мышей.Одновременно проводили монотерапию ФДТ, IgBD-TRAIL и TRAIL. Для сравнения способности этих методов лечения индуцировать апоптоз опухолевые трансплантаты собирали через 24 часа после обработки для обнаружения апоптотических клеток с использованием анализа мечения ник-концов dUTP терминальной дезоксинуклеотидилтрансферазы (TUNEL) (Promega, WI), иммунофлуоресценции с антителом против расщепленной каспазы 3 или расщепленного PARP. . Пролиферативные клетки в трансплантатах опухоли проиллюстрировали с использованием Ki67 в качестве индикатора. Одновременно повреждение тканей в этих опухолевых трансплантатах и ​​нормальных тканях (печени и почках) было проиллюстрировано окрашиванием H&E.

Статистический анализ

Односторонний дисперсионный анализ (ANOVA) для множественных сравнений был выполнен с использованием программного обеспечения SPSS версии 17.0. Результаты выражены как среднее значение ± стандартная ошибка (SEM), а уровень значимости был определен как p < 0,05.

Результаты

Монотерапия TRAIL длительного действия уничтожает большие опухолевые трансплантаты клеток CRC с химиотерапевтическим МЛУ, но не клеток CRC с химиотерапевтическим МЛУ и резистентностью к TRAIL.

TRAIL длительного действия, i.е. , IgBD-TRAIL, был сконструирован путем слияния IgG-связывающего домена (IgBD) с N-концом TRAIL, что позволило IgBD-TRAIL связывать IgG (фигура A). Согласно нашим предыдущим работам 28 , поскольку IgG демонстрирует длительную циркуляцию в крови, период полужизни IgG-связывающего IgBD-TRAIL в сыворотке был увеличен в 50-60 раз, чем у TRAIL, что демонстрирует больший противоопухолевый эффект. Здесь, перед оценкой синергизма между IgBD-TRAIL и PDT, мы проверили способность связывания IgG и длительную циркуляцию IgBD-TRAIL.После инкубации IgBD-TRAIL с mIgG анализ SEC продемонстрировал новый пик белка с кажущейся молекулярной массой, которая определенно была выше, чем у отдельного mIgG (фигура A), что указывает на то, что IgBD-TRAIL может связывать IgG. Для сравнения клиренса крови образцы плазмы мышей, которым вводили однократную дозу IgBD-TRAIL или TRAIL, собирали в разные моменты времени для анализа цитотоксичности. Как показано на фиг. А, цитотоксичность образцов крови мышей, которым инъецировали TRAIL, не определялась через 2 часа после инъекции.Однако цитотоксичность образцов крови мышей, которым вводили IgBD-TRAIL, сохранялась по крайней мере 24 часа. Эти результаты показали, что IgBD-TRAIL может связывать эндогенный IgG, таким образом показывая значительно увеличенный период полужизни в сыворотке.

Противоопухолевый эффект белков TRAIL у мышей, несущих опухолевые трансплантаты клеток CRC. A. Характеристика белков TRAIL. IgBD-TRAIL продуцировали путем слияния IgG-связывающего домена (IgBD) с N-концом TRAIL. Связывание IgBD-TRAIL с mIgG анализировали с помощью SEC.Разница в клиренсе крови IgBD-TRAIL и TRAIL отражалась в зависимом от времени снижении гибели клеток, вызванном остаточными белками в плазме (разведенных в 25, 50 и 250 раз). B. Экспрессия DR4 и DR5. Указаны проценты клеток, положительных по рецептору смерти. C. Цитотоксичность белков TRAIL. D. Противоопухолевый эффект однократной дозы белков TRAIL, вводимой в день 0 мышам (N = 5-6), несущим опухолевые трансплантаты клеток COLO 205, LS174T или HT29.Трансплантаты опухоли COLO 205 обрабатывали 3 мг / кг IgBD-TRAIL (IgBD-TRAIL-3) или 10 мг / кг TRAIL (TRAIL-10). Мышей, несущих опухолевые трансплантаты LS174T или HT29, обрабатывали 10 мг / кг белков TRAIL.

Клетки CRC, включая COLO 205, COLO 320 DR, COLO 320 HSR, LS174T, HT29, HCT-8, HCT116, LOVO, RKO, T84 и LS180, устойчивы к нескольким химическим препаратам, таким как цисплатин, винкристин, доксорубицин. , и бортезомиб (рис. S1A), что указывает на то, что химиотерапевтический МЛУ распространен в клетках CRC. Из-за экспрессии рецепторов поверхностной смерти DR4 и DR5 (фигура B) TRAIL продемонстрировал цитотоксичность в этих клетках CRC, которая может преодолевать химиотерапевтическую MDR клеток CRC.Как показано на Фигуре C и Фигуре S1B, TRAIL проявлял сильную цитотоксичность в клетках COLO 205 и HCT116. Тем не менее, IC50 TRAIL в клетках LS174T и LS180 (30-40 нМ), HT29 и LOVO (200-300 нМ) и других клетках CRC (> 500 нМ) были намного выше, чем у TRAIL в клетках COLO 205 и HCT116 ( 0,2-0,5 нМ). Следовательно, в этой статье клетки COLO 205 и HCT116 с химиотерапевтическим МЛУ были определены как TRAIL-чувствительные клетки. Другие клетки CRC с химиотерапевтическим MDR были определены как TRAIL-устойчивые клетки.Хотя цитотоксичность in vitro TRAIL была аналогична цитотоксичности IgBD-TRAIL в клетках COLO 205 (Рисунок C), внутривенная инъекция одной низкой дозы (3 мг / кг) IgBD-TRAIL, но не высокой дозы ( 10 мг / кг) TRAIL ликвидировал большие (~ 300 мм 3 ) опухолевые трансплантаты клеток COLO 205 в течение 1 недели. Анализ поглощения опухолью показал, что IgBD-TRAIL с длительной циркуляцией накапливает больше, чем TRAIL в трансплантатах опухоли (фигура S2), способствуя большему противоопухолевому эффекту IgBD-TRAIL.Неожиданно, IgBD-TRAIL показал только слабое или умеренное подавление роста на трансплантатах опухоли HT29 и LS174T, что указывает на необходимость комбинировать IgBD-TRAIL с сенсибилизаторами для борьбы с этими клетками CRC с химиотерапевтической MDR и TRAIL-устойчивостью.

Монотерапия ФДТ, нацеленной на опухолевые клетки, эффективно индуцирует гибель клеток CRC с химиотерапевтической устойчивостью к МЛУ и TRAIL, но не может уничтожить их опухолевые трансплантаты

Для выполнения ФДТ, нацеленной на опухолевые клетки, использовали EGFR-специфический Z EGFR (Ze) affibody в качестве носителя для фотосенсибилизатора IR700.Как показано на Фигуре A, аффибоди Ze, выделенного из E. coli , проявлялся в виде единственной полосы белка на геле SDS-PAGE и единственного пика белка на колонке SEC, что указывает на то, что аффитело Ze было очищено до гомогенности. Анализ белок-белкового взаимодействия показал, что аффинное тело Ze связывает EGFR с субнаномолярной аффинностью (KD = 0,43 ± 0,57 нМ, фигура B). Анализ проточной цитометрии продемонстрировал, что аффитело Ze может связывать EGFR-экспрессирующие клетки LS174T и HT29 (рис. C). Более того, внутривенно введенное аффибоди Ze преимущественно распределялось на EGFR-экспрессирующих клетках (фигура D, фигура S3A), таким образом накапливая в трансплантатах опухоли LS174T у мышей (фигура E).Напротив, аффитело Ze, расщепленное трипсином (Ze-TN), не обнаруживалось в трансплантатах опухоли (фигура S3B, C). Эти результаты продемонстрировали, что аффитело Ze может накапливаться в опухолевых трансплантатах клеток CRC, экспрессирующих EGFR, что указывает на потенциал аффибоди Ze в качестве носителя для фотосенсибилизатора.

Характеристики самонаведения опухоли Ze affibody с высоким сродством к EGFR. A. SDS-PAGE и SEC анализ очищенного аффибоди Ze. B. Связывание аффибоди Ze с EGFR анализировали с помощью интерферометрии биослоя. C. Экспрессия EGFR в клетках LS174T и HT29 и связывание аффибоди Ze с этими клетками. D. Клеточное распределение аффибоди Ze в трансплантатах опухоли LS174T. E. Распределение Ze affibody в тканях мышей, несущих опухолевые трансплантаты LS174T. Органы / ткани, полученные от мышей (N = 3), сканировали с помощью оптической системы визуализации IVIS через 4 часа после инъекции CF750-меченного аффибоди Ze.

Впоследствии фотосенсибилизатор IR700 был конъюгирован с аффителом Ze для получения Ze-IR700, нацеленного на EGFR (рис. A).Анализ проточной цитометрии продемонстрировал, что Ze-IR700 может связывать клетки LS174T и HT29 (рисунок B). После инкубации с клетками при 37 ° C в течение 0,5 ч Ze-IR700 мог проникать в клетки LS174T и преимущественно распределялся в лизосомах (Рисунок C), но не в митохондриях (Рисунок S4). Для определения гибели клеток, вызванной PDT, клетки CRC инкубировали с Ze-IR700 или трипсинизированным Ze-IR700 (Ze-IR700-TN) с последующими двумя промываниями средой перед облучением. Анализы DCFH и SOSG продемонстрировали, что Ze-IR700, но не опосредованная Ze-IR700-TN ФДТ, продуцировала высокие уровни ROS (Рисунок D).Соответственно, опосредованная Ze-IR700 ФДТ индуцировала более 90% гибели клеток в клетках LS174T и HT29. Напротив, одинаковое количество Ze-IR700-TN-опосредованной PDT показало небольшую цитотоксичность для обоих типов клеток (фигура E и фигура S5A). У мышей, несущих большие (~ 150 мм 3 ) опухолевые трансплантаты клеток LS174T или HT29, ФДТ оказывала зависимое от дозы подавление роста опухоли Ze-IR700. Как показано на Фигуре F, ФДТ, опосредованная 1 мг / кг Ze-IR700, показала очевидное подавление роста опухоли. Когда количество Ze-IR700 было увеличено с 1 мг / кг (Ze-IR700-1) до 3 мг / кг (Ze-IR700-3), подавление роста опухоли с помощью PDT еще больше усилилось.Однако как 1, так и 3 мг / кг Ze-IR700-опосредованная PDT не уничтожала каких-либо опухолевых трансплантатов у этих мышей. Эти результаты продемонстрировали, что монотерапия Ze-IR700-опосредованной PDT оказывала сильное подавление роста опухоли, но не уничтожала опухолевые трансплантаты этих клеток CRC с химиотерапевтической устойчивостью к MDR и TRAIL.

Противоопухолевый эффект Ze-IR700-опосредованной PDT у мышей, несущих опухолевые трансплантаты клеток CRC. A. Получение Ze-IR700 путем конъюгирования фотосенсора IR700 с Ze affibody. B. Связывание Ze-IR700 с клетками LS174T и HT29. C. Накопление Ze-IR700 в лизосомах клеток LS174T. D. АФК, продуцируемые в клетках LS174T, обработанных Ze-IR700- или трипсинизированным Ze-IR700 (Ze-IR700-TN) -опосредованной PDT. E. Гибель клеток LS174T и HT29, обработанных Ze-IR700- или Ze-IR700-TN-опосредованной PDT. F. Подавление роста опухоли посредством ФДТ, опосредованной Ze-IR700. Мышам (N = 5), несущим опухолевые трансплантаты LS174T или HT29, внутривенно вводили 1 мг / кг (Ze-IR700-1) или 3 мг / кг (Ze-IR700-3) Ze-IR700 с последующим облучением через 4 часа.

ФДТ, нацеленная на опухолевые клетки, сенсибилизирует клетки CRC к TRAIL путем активации рецепторов смерти и подавления рецепторов-ловушек

Анализ гибели клеток показал, что ФДТ, опосредованная Ze-IR700, индуцировала каспазозависимый апоптоз в клетках LS174T (рис. S5B, C). Анализ секвенирования РНК показал, что связанные с митохондриями проапоптотические белки, включая Bid, BAD, BAK1, BOK и BAX, подавлялись в клетках LS174T с помощью сублетальной PDT. Однако PDT индуцировала повышенную регуляцию проапоптотических белков, таких как каспазы (CSCP 2, 8), APAF1, DDIT3, катепсины (CTSC, CTSD), TP53, ATM и DFFA (рисунок A и таблица S1), что позволяет предположить, что PDT преимущественно индуцированный апоптоз, связанный с лизосомами.Помимо позитивной регуляции проапоптотических факторов, Ze-IR700-опосредованная PDT также увеличивала экспрессию антиапоптотических генов, таких как BCL2, BCL2L1, BIRC2 и BIRC6, XIAP, CFLAR, FAIM, HRAS и NRAS, семейство ELF (ELF1, 2 , 4), семейство PARP (PARP2, 4), PIK3CA, PIK3R1 и PIK3R3 (рисунок B и таблица S2), что указывает на возможность усиления противоопухолевого эффекта PDT за счет комбинации с другим индуктором апоптоза.

Ze-IR700-опосредованная PDT активировала рецепторы TRAIL и проявляла синергетическую цитотоксичность с белками TRAIL в клетках LS174T.А, Б, В. Профили экспрессии проапототических генов (A), антиапоптотических генов (B), рецепторов смерти и рецепторов-ловушек (C) в клетках LS174T, обработанных с ФДТ или без нее. D. Анализ проточной цитометрии DR4 и DR5 в клетках LS174T, обработанных с или без PDT. E . Цитотоксичность белков TRAIL в клетках LS174T, обработанных с ФДТ или без нее. F. Профиль экспрессии DR4 и DR5 в опухолевых тканях, обработанных с помощью или без PDT. Ткани опухоли, собранные перед PDT (PDT-0) или через 2 часа после PDT (PDT-120), замораживали и окрашивали антителом против DR4 или DR5.Микрососуды опухоли проиллюстрировали окрашиванием CD31. Ядра визуализировали окрашиванием DAPI.

Примечательно, что анализ секвенирования РНК показал, что Ze-IR700-опосредованная PDT значительно ( p < 0,01) увеличивала экспрессию мембранных рецепторов TRAIL, включая рецептор смерти DR4 (TNFRSF10A) и DR5 (TNFRSF10B). Однако рецепторы-ловушки TRAIL, включая DcR1 (TNFRSF10C) и DcR2 (TNFRSF10D), были подавлены (фигура C и таблица S3), что свидетельствует об эффективном синергизме между PDT и TRAIL в индукции апоптоза клеток CRC.Анализ проточной цитометрии подтвердил активацию DR4 и DR5 в клетках LS174T после лечения PDT. Как показано на рисунке D, положительные показатели рецепторов смерти в LS174T, обработанном Ze-IR700-опосредованной ФДТ, составляли 83,9% (DR4) и 96,5% (DR5) по сравнению с 16,5% (DR4) и 27,4% (DR5) этого количества. в необработанных клетках LS174T. Дальнейший вестерн-блоттинг показал, что PDT-индуцированная активация DR4 и DR5 и подавление DcR1 в клетках LS174T. Добавление антиоксиданта NAC в клетки устраняет влияние PDT на экспрессию рецептора смерти и рецептора-ловушки в этих клетках (фиг. S6A), что указывает на то, что PDT активирует рецепторы TRAIL посредством ROS.Соответственно, чувствительность клеток LS174T к белкам TRAIL была резко увеличена с помощью ФДТ. IC50 IgBD-TRAIL и TRAIL в клетках LS174T, обработанных PDT, были более чем в 10-40 раз (приблизительно 1-3 нМ против 30-40 нМ) ниже, чем IC50 в клетках LS174T без обработки PDT (Рисунок E), демонстрируя синергизм между Белки PDT и TRAIL в уничтожении клеток CRC. Добавление растворимого DR4-Fc или DR5-Fc в клетки CRC, обработанные PDT, аннулировало синергию (фиг. S6B), указывая на то, что синергизм между PDT и белком TRAIL в уничтожении клеток CRC зависит от рецептора смерти.Более того, экспрессия DR4 и DR5 в опухолевых тканях определенно увеличивалась после лечения PDT (фиг. F), предполагая, что опосредованная Ze-IR700 PDT будет сенсибилизировать опухолевые клетки к белку TRAIL в условиях in vivo . Хотя клетки HT29 проявляли большую химиотерапевтическую MDR и TRAIL-резистентность, чем клетки LS174T, in vitro Ze-IR700-опосредованная PDT также активировала мембранный DR4 (с 13,6% до 29%) и DR5 (с 20,6% до 41,1%). в ячейках HT29 (рисунок S7A). Соответственно, IC50 белков TRAIL в клетках HT29, обработанных PDT, были примерно в 20-60 раз (5-10 нМ против 200-300 нМ) ниже, чем IC50 в клетках HT29 без обработки PDT (рисунок S7B), что указывает на то, что PDT также резко повышает сенсибилизацию. Клетки HT29 на белки TRAIL путем активации рецепторов смерти.Более того, предварительная обработка Ze-IR700-опосредованной PDT увеличивала цитотоксичность TRAIL в клетках COLO 320 DR, COLO 320 HSR, HCT-8, LOVO, RKO, LS180, T84 и HCT116 (рисунок S7C), что указывает на то, что опухолевые клетки нацелены на PDT сильно сенсибилизировал клетки CRC к TRAIL. Тот факт, что подавление DR4 или DR5 отменяет синергизм между PDT и TRAIL в уничтожении клеток HCT116, предполагает, что PDT сенсибилизирует другие клетки CRC к TRAIL за счет увеличения экспрессии рецепторов смерти (фиг. S8).

Комбинированная терапия IgBD-TRAIL и ФДТ, нацеленная на опухолевые клетки, эффективно уничтожает большие опухолевые трансплантаты клеток CRC с химиотерапевтическим MDR и резистентностью к TRAIL

Помимо сенсибилизации клеток CRC к TRAIL, Ze-IR700-опосредованный in vivo PDT также нарушили сосудистую систему опухолевых трансплантатов.Как показано на фиг. S9A, в трансплантатах опухоли LS174T, собранных через 2 часа (PDT-120) и 6 часов (PDT-360) после PDT, наблюдались многочисленные эритроциты и сгустки крови. Соответственно, экспрессия HIF1α в опухолевых тканях увеличивалась со временем после ФДТ (фиг. S9B), указывая на то, что ФДТ разрушала сосуды опухоли и вызывала кровотечение и тромбоз, что еще больше усиливало гипоксию в трансплантатах опухоли. Из-за разрушения сосудов опухоли захват белков TRAIL опухолевыми трансплантатами LS174T был значительно увеличен (Рисунок A).Примечательно, что поглощение опухолью длительного действия IgBD-TRAIL было больше, чем поглощение TRAIL с коротким периодом полувыведения из сыворотки.

ФДТ, опосредованная Ze-IR700, увеличивала захват опухолью и индукцию апоптоза белков TRAIL в трансплантатах опухоли LS174T. А. Поглощение белков TRAIL опухолевыми трансплантатами, обработанными с ФДТ или без нее. B. Индукция апоптоза белков TRAIL в трансплантатах опухоли, обработанных с помощью или без PDT. Ткани опухоли собирали через 24 часа после обработки, и апоптотические клетки визуализировали окрашиванием TUNEL.Ядра проиллюстрировали окрашиванием DAPI. Скорость апоптоза выражали как отношение TUNEL-положительных клеток (апоптотических клеток) к DAPI-положительным клеткам (общее количество клеток). C. Гистология опухолевых трансплантатов, обработанных монотерапией или комбинированной терапией белков TRAIL и PDT. Ткани опухоли собирали через 24 часа после обработки и окрашивали H&E.

Последующие анализы индукции апоптоза продемонстрировали, что комбинация белков TRAIL и опосредованной Ze-IR700 PDT индуцировала больший апоптоз в трансплантатах опухоли LS174T, чем монотерапия либо белками TRAIL, либо PDT.Как показано на Фигуре B, процент апоптотических клеток в трансплантатах опухоли LS174T, обработанных 1 мг / кг Ze-IR700-опосредованной PDT, составлял 6,1 ± 4,2%. Частота апоптоза в трансплантатах опухолей, обработанных монотерапией TRAIL и IgBD-TRAIL, составила 11,9 ± 4,4% и 34,7 ± 7,9% соответственно. Однако частота апоптотических клеток в трансплантатах опухолей, обработанных TRAIL / PDT и IgBD-TRAIL / PDT, составила 35,8 ± 19,3% и 86,5 ± 8,1% соответственно, что намного выше, чем при монотерапии. Соответственно, комбинированная терапия IgBD-TRAIL и PDT индуцировала большую активацию каспаз in vitro (фиг. S10A) и in vivo (фиг. S10B).Пролиферативных клеток в опухолевых трансплантатах, обработанных комбинированной терапией, было определенно меньше, чем в опухолевых трансплантатах, обработанных монотерапией (фигура S10B). Дальнейший гистохимический анализ показал, что монотерапия Ze-IR700-опосредованной PDT, TRAIL или IgBD-TRAIL только частично повреждает ткани опухоли. Хотя комбинированная терапия с использованием TRAIL и PDT сильно повредила опухолевые трансплантаты, многие опухолевые ткани все еще были видны на краях опухолевых трансплантатов. Однако комбинация IgBD-TRAIL и Ze-IR700-опосредованной PDT повреждает большинство опухолевых тканей в трансплантатах опухоли LS174T (фигура C).Эти результаты показали, что ФДТ, нацеленная на опухолевые клетки, усиливает in vivo -зависимую от каспазы индукцию апоптоза белков TRAIL.

Противоопухолевый эффект белков TRAIL в сочетании с Ze-IR700-опосредованной PDT или без нее был сначала оценен на мышах, несущих опухолевые трансплантаты (~ 150 мм 3 ) нативных клеток LS174T или клеток LS174T, экспрессирующих RFP. Как показано на рисунке А, оптические изображения продемонстрировали, что флуоресценция опухолевых трансплантатов увеличивается со временем после обработки белками TRAIL.После лечения с помощью Ze-IR700-опосредованной ФДТ и комбинированной терапии с помощью TRAIL и ФДТ флуоресценция в большинстве опухолевых трансплантатов снизилась в ранние сроки (2-3 дня) после лечения. Однако флуоресценция во всех опухолевых трансплантатах, обработанных комбинированной терапией IgBD-TRAIL и PDT, не определялась со второго дня после лечения. Кривые роста опухоли продемонстрировали, что монотерапия TRAIL не показала подавления опухоли по сравнению с контролем PBS. Монотерапия Ze-IR700-опосредованной PDT или IgBD-TRAIL показала умеренное подавление роста опухоли.Комбинированная терапия TRAIL и PDT вызвала отсутствие прогрессирования в течение одной недели после лечения. Однако очевидное кровотечение, сопровождающееся образованием струпа, наблюдалось во всех опухолевых трансплантатах, обработанных комбинированной терапией IgBD-TRAIL и PDT, начиная со второго дня после лечения. В последующие дни эти опухолевые трансплантаты непрерывно сокращались, за чем следовало поглощение или выделение из организма (Рисунок B). В конце этого наблюдения 70% (9 из 13) опухолевых трансплантатов были уничтожены (Рисунок B, C и Рисунок S11A).Эти результаты продемонстрировали, что Ze-IR700-опосредованные белки PDT и TRAIL проявляли синергетический противоопухолевый эффект. Однако комбинация IgBD-TRAIL длительного действия, но не TRAIL с коротким периодом полужизни в сыворотке, и PDT эффективно уничтожала трансплантаты опухоли LS174T.

Противоопухолевый эффект комбинированной терапии белков TRAIL и опосредованной Ze-IR700 ФДТ у мышей, несущих трансплантаты опухоли LS174T. A. Динамическая оптическая визуализация мышей, несущих опухолевые трансплантаты RFP-экспрессирующих клеток LS174T, обработанных белками TRAIL в комбинации с PDT или без нее. B. Типичные изображения мышей с трансплантатами опухоли до и после лечения комбинированной терапией IgBD-TRAIL и PDT. C. Кривые роста опухолевых трансплантатов после лечения монотерапией или комбинированной терапией протеинами TRAIL и PDT. Однократное лечение проводили в день 0. Указано количество мышей с эрадикацией опухоли (без опухоли).

Подобно таковому в опухолевых трансплантатах LS174T, Ze-IR700-опосредованная PDT также увеличивала поглощение TRAIL, как и IgBD-TRAIL опухолевыми трансплантатами HT29 (фигура A).По сравнению с TRAIL с коротким периодом полувыведения из сыворотки, IgBD-TRAIL длительного действия в сочетании с Ze-IR700-опосредованной PDT вызывал больший (72,6 ± 12,8% против 28,3 ± 8,7%) апоптоз в трансплантатах опухоли HT29 (рисунок B). Кривые роста опухоли продемонстрировали, что монотерапия Ze-IR700-опосредованной PDT или белков TRAIL показала небольшое подавление роста опухоли. Комбинированная терапия TRAIL и PDT только уменьшила рост опухоли в течение короткого периода (3-4 дня) после лечения. Однако комбинация IgBD-TRAIL и PDT резко повредила трансплантаты опухоли HT29, что вызвало обширное кровотечение и образование струпа после 2 -го или 3 -го дня после лечения.В течение следующих дней у большинства мышей наблюдали абсорбцию или отслаивание трансплантата опухоли. В конце наблюдения 50% (6 из 12) опухолевых трансплантатов были уничтожены комбинированной терапией IgBD-TRAIL и PDT (Рисунок C, Рисунок S11B). Оптические изображения мышей, несущих опухолевые трансплантаты из RFP-экспрессирующих клеток HT29, подтвердили подавление роста опухоли, а также уничтожение опухолевых трансплантатов при комбинированной терапии белков TRAIL и PDT (Рисунок D, Рисунок S12). Эти результаты продемонстрировали, что комбинация TRAIL длительного действия, но не TRAIL, с коротким периодом полужизни в сыворотке также высокоэффективна против трансплантатов опухоли HT29.

Противоопухолевый эффект комбинированной терапии белков TRAIL и опосредованной Ze-IR700 ФДТ у мышей, несущих опухолевые трансплантаты HT29. А. Поглощение белков TRAIL опухолевыми трансплантатами, обработанными с ФДТ или без нее. B. Индукция апоптоза с помощью монотерапии или комбинированной терапии белков TRAIL и PDT в трансплантатах опухоли. C. Кривые роста опухолевых трансплантатов, обработанных монотерапией или комбинированной терапией белков TRAIL и PDT. Указывается количество мышей с эрадикацией опухоли (без опухоли). D. Типичные оптические изображения мышей с трансплантатами опухоли во время лечения комбинированной терапией IgBD-TRAIL и PDT. Однократное лечение проводили в день 0.

Как показано на фиг. S13, монотерапия IgBD-TRAIL и TRAIL у мышей, несущих опухолевые трансплантаты, не показала очевидного снижения массы тела мышей. Тем не менее, TRAIL, особенно IgBD-TRAIL в сочетании с PDT, вызывал небольшое (~ 10%) снижение массы тела мышей, несущих трансплантаты опухоли LS174T, в течение первых 4 дней после лечения.Однако гистохимический анализ печени и почек, собранный у этих мышей в конце наблюдения (день 16), не показал явных отклонений в структуре. Снижение массы тела, опосредованное комбинированной терапией IgBD-TRAIL и ФДТ, составило менее 5%. Эти результаты позволяют предположить, что комбинированная терапия IgBD-TRAIL и PDT может вызвать легкое острое повреждение у мышей.

Обсуждение

Высокий уровень смертности, связанной с CRC, в основном объясняется МЛУ клеток CRC, конститутивно экспрессирующих переносчики ABC, в химиотерапевтические препараты первой линии 2 , 4 .Фактически, клетки CRC широко устойчивы к химическим препаратам, таким как цисплатин, винкристин, доксорубицин и бортезомиб (рис. S1A), что указывает на то, что химиотерапевтическая МЛУ распространена в клетках CRC. Поскольку большие белки с различными механизмами могут обходить пути устойчивости к небольшим химическим веществам, TRAIL, обладающий цитотоксичностью в отношении химически устойчивых раковых клеток, рассматривается как новый терапевтический вариант для лечения резистентных видов рака 30 . В нашей предыдущей работе новый вариант TRAIL, i.е. , IgBD-TRAIL, был получен путем слияния IgG-связывающего домена с N-концом TRAIL 28 . Благодаря IgBD-опосредованному связыванию с эндогенным IgG, IgBD-TRAIL показал более длительный период полужизни в сыворотке и, таким образом, проявил больший противоопухолевый эффект, чем нативный TRAIL. У мышей, несущих TRAIL-чувствительные клетки COLO 205, системное введение низких доз (3 мг / кг) IgBD-TRAIL уничтожило все большие (~ 300 мм 3 ) опухолевые трансплантаты (Рисунок D), что вызвало у нас интерес к исследованию потенциал IgBD-TRAIL в борьбе с CRC с большей МЛУ.Было обнаружено, что клетки LS174T и HT29 CRC были более устойчивы, чем клетки COLO 205, к цисплатину, винкристину, доксорубицину, бортезомибу (рисунок S1A) и TRAIL (рисунок C). Соответственно, внутривенная инъекция высокой дозы (10 мг / кг) IgBD-TRAIL показала только умеренное подавление роста опухоли у мышей, несущих опухолевые трансплантаты LS174T или HT29 (Рисунок D), что указывает на то, что монотерапия белков TRAIL обнадеживает, но неэффективна для борьбы с клетками CRC. с химиотерапевтической устойчивостью к МЛУ и TRAIL. Определенно, необходимо разработать комбинированные стратегии для преодоления химиотерапевтической MDR и TRAIL-устойчивости клеток CRC.

TRAIL индуцирует апоптоз путем связывания с рецепторами смерти на поверхности раковых клеток 31 , что предполагает возможность повышения цитотоксичности TRAIL за счет увеличения мембранного DR4 и / или DR5. Сообщалось, что ROS могут увеличивать экспрессию рецептора смерти в раковых клетках 17 , что предполагает синергизм между PDT, продуцирующим ROS 20 , 21 и TRAIL в уничтожении клеток CRC с химиотерапевтической устойчивостью к MDR и TRAIL.Фактически, мы обнаружили, что опосредованная Ze-IR700 PDT продуцирует ROS и, таким образом, индуцирует апоптоз клеток LS174T (Рисунок D и E, Рисунок S5). Дальнейший анализ секвенирования РНК продемонстрировал, что сублетальная доза Ze-IR700-опосредованной PDT преимущественно ( P < 0,01) индуцировала связанные с лизосомами проапоптотические факторы в клетках LS174T (рисунок A, таблица S1). Неожиданно оказалось, что ФДТ, опосредованная Ze-IR700, также увеличила ряд генов, направленных против апоптоза и связанных с пролиферацией клеток (фигура B, таблица S2), что позволяет предположить, что монотерапия PDT может проявлять ограниченный противоопухолевый эффект.Фактически, монотерапия Ze-IR700-опосредованной PDT приводила к подавлению роста опухоли, но не к уничтожению каких-либо опухолевых трансплантатов клеток LS174T и HT29 с химиотерапевтической устойчивостью к MDR и TRAIL (фигура F).

Подобно Ze-IR700-опосредованной PDT, TRAIL также индуцировал апоптоз клеток LS174T (фиг. S5B, C), предполагая перекрестные помехи между PDT и TRAIL-опосредованными путями гибели клеток. Интересно, что ФДТ, опосредованная Ze-IR700, значительно усиливала экспрессию рецепторов смерти для TRAIL (DR4 и DR5) как в клетках LS174T (Рисунок C, 4D, Рисунок S6A, Таблица S3), так и в клетках HT29 (Рисунок S7A), тогда как рецепторы-ловушки TRAIL (DcR1 и DcR2) в клетках LS174T подавлялась PDT (фигура C, фигура S6A, таблица S3).Эти результаты предполагают синергизм между TRAIL и PDT в уничтожении клеток CRC. Фактически, чувствительность клеток LS174T и HT29 была увеличена в 10-60 раз с помощью PDT (Рисунок E, Рисунок S7B). Кроме того, опосредованная Ze-IR700 PDT также сенсибилизировала другие клетки CRC, такие как клетки COLO 320DM, COLO 320HSR, LOVO, T84, HCT-8, RKO, LS180 и HCT116, к TRAIL (рисунок S7C). Поскольку эти клетки CRC также устойчивы к химическим веществам (цисплатин, винкристин, доксорубицин и бортезомиб) и белкам TRAIL (TRAIL и IgBD-TRAIL) (рисунок S1), обширная сенсибилизация этих клеток к белкам TRAIL с помощью PDT предполагает потенциал комбинированной терапии. белков TRAIL и ФДТ, нацеленной на опухолевые клетки, в борьбе с рефрактерным CRC.

Согласно нашим результатам, период полужизни белков TRAIL в сыворотке тесно связан с синергическим противоопухолевым действием этих белков и PDT. С одной стороны, белок TRAIL с более длительным периодом полужизни в сыворотке может получить больше шансов на связывание и уничтожение опухолевых клеток, сенсибилизированных ФДТ. Как показано в Таблице S3, и DR4, и DR5 лишь незначительно индуцировались в течение 1 часа после PDT, тогда как их экспрессия увеличивалась примерно в два раза через 24 часа после PDT, что указывает на то, что индукция рецепторов TRAIL требует много времени.Однако TRAIL с коротким периодом полувыведения из сыворотки был исключен из крови в течение 0,5 часа после инъекции, тогда как цитотоксичность того же количества IgBD-TRAIL сохранялась по крайней мере 24 часа (Рисунок A). Хотя ФДТ увеличивала цитотоксичность in vitro IgBD-TRAIL и TRAIL до аналогичной степени (фигура E, фигура S7B), комбинация IgBD-TRAIL длительного действия и PDT вызывала больший апоптоз, чем TRAIL, с коротким периодом полужизни в сыворотке. в сочетании с PDT в трансплантатах опухоли (Рисунок B, Рисунок B).С другой стороны, помимо сенсибилизации клеток CRC, in vivo PDT обычно повреждает сосудистую систему опухолевых трансплантатов, что вызывает сверхусиленные эффекты проницаемости и удерживания, тем самым облегчая попадание лекарств в ложе опухоли 32 . Фактически, индуцированное PDT кровотечение, сопровождающееся увеличением поглощения опухолью белков TRAIL, наблюдалось как в трансплантатах опухоли LS174T, так и в HT29 (Рисунок A, Рисунок A). Однако поглощение опухолью длительного действия IgBD-TRAIL было намного больше, чем поглощение TRAIL с коротким периодом полувыведения из сыворотки.Следовательно, комбинация IgBD-TRAIL, но не TRAIL и PDT, эффективно уничтожала опухолевые трансплантаты клеток CRC с химиотерапевтической устойчивостью к MDR и TRAIL (фигура C, фигура C).

Для дальнейшей оценки вклада ФДТ в преодоление химиотерапевтической МЛУ клеток CRC мы сравнили уровни экспрессии транспортеров ABC в клетках LS174T, обработанных с ФДТ или без нее. Из переносчиков ABC, по крайней мере, подсемейства ABCB, ABCC и ABCG участвуют в МЛУ раковых клеток 33 .Как показано на фиг. S14 и в таблице S4, в клетках LS174T, обработанных PDT, наблюдали как повышающую, так и понижающую регуляцию MDR-ассоциированных транспортеров ABC. Транспортеры ABC с повышенной регуляцией включали ABCB1 (p-гликопротеин, pGP), ABCB10, ABCC1-5 (белок 1-5, связанный с множественной лекарственной устойчивостью, MRP1-5) и ABCC9, 10 и 11. Транспортеры ABC с пониженной регуляцией включали ABCB4, ABCB6-9 , ABCC6 и ABCG2 (белок 1 устойчивости к раку молочной железы, BCRP1). В энтероцитах pGP, MRP1-5 и BCRP1 отвечают за отток химических препаратов 4 .За исключением BCRP1, Ze-IR700-опосредованная PDT увеличивала все остальные шесть переносчиков оттока в клетках LS174T (рисунок S14, таблица S4), что могло увеличивать химиотерапевтический MDR CRC. Эти результаты предполагают, что комбинация химических препаратов и ФДТ может иметь небольшой синергетический противоопухолевый эффект на CRC с MDR. Поскольку PDT индуцировал апоптоз клеток CRC (рисунок S5B), комбинация индукторов апоптоза на основе белков, включая TRAIL, лиганд Fas (Fas L) и фактор некроза опухоли α (TNFα), теоретически имеет больший потенциал для преодоления химиотерапевтического MDR CRC. .Фактически, PDT значительно увеличивал количество рецепторов смерти DR4 и DR5 для TRAIL, Fas для Fas L и TNFRSF1A для TNFα (Рисунок C и Таблица S3), обеспечивая молекулярную основу для синергизма между PDT и TRAIL, Fas L и TNFα в уничтожении CRC клетки. Однако из-за неэффективности растворимого Fas L в индукции апоптоза 34 и систематической токсичности TNFα 35 , эффективный TRAIL без ограниченной дозы токсичности должен быть лучшим выбором для комбинации с PDT в терапии рака.

Взятые вместе, наши результаты продемонстрировали, что Ze-IR700-опосредованная PDT резко повышала чувствительность клеток LS174T и HT29 к TRAIL-белкам за счет активации рецепторов смерти и что комбинация IgBD-TRAIL длительного действия и PDT эффективно уничтожала опухолевые трансплантаты обеих клеток CRC. . Поскольку Ze-IR700-опосредованная ФДТ сильно сенсибилизировала клетки CRC к белкам TRAIL (рис. S7C), наряду с развитием технологии лазерной доставки с помощью эндоскопа, ФДТ, нацеленная на опухолевые клетки в сочетании с TRAIL длительного действия, имеет большой потенциал для борьбы с неоперабельными первичными, так как а также метастатический CRC.Учитывая хорошую биобезопасность TRAIL и PDT у пациентов, важно провести клиническое воплощение этой комбинированной стратегии в прецизионной терапии CRC. Примечательно, что хотя комбинированная терапия IgBD-TRAIL и PDT вызвала временное снижение массы тела у мышей, несущих трансплантаты опухоли CRC (рис. S13), биобезопасность этой комбинированной стратегии должна быть дополнительно оценена в будущем. Помимо белков TRAIL, также интересно комбинировать PDT с другим форматом TRAIL, таким как TRAIL 36 , опосредованный онколитическим вирусом, и TRAIL 37 , 38 , доставляемый стволовыми клетками, для терапии, направленной на CRC.

«Проблемы развития информационных систем в стране, готовящейся к f» Хосе Грикар, Франк Бракун и др.

Абстрактные

Несколько стран готовятся присоединиться к Европейскому Союзу в ближайшие несколько лет, и в ближайшие годы их число будет увеличиваться. Как информационные технологии могут поддержать эти усилия? В этой работе участвуют несколько заинтересованных сторон: правительство, бизнес, профессиональные ассоциации и образовательные учреждения. Как они могут помочь в использовании информационных технологий для поддержки процесса перехода и ускорения рыночной ориентации? Европейская интеграция является частью более широких процессов глобализации, которым способствуют информационные технологии.Как страны должны к этому готовиться? Глобальное подключение к Интернету открывает новые возможности для динамично развивающихся стран, готовящихся к электронной коммерции, электронному правительству и электронной демократии. Какую роль в этом играют профессиональные организации и университеты? Эксперт будет опираться на пример Словении, чтобы развить общие идеи совместной работы в процессе европейской интеграции с использованием информационных технологий для ускоренного развития. Поскольку коммерция переопределяется динамикой Интернета и других технологий электронной коммерции, участники дискуссии проанализируют нынешнюю ситуацию в Словении и обратятся к будущим изменениям.Они представят словенский пример универсальной торговли, в рамках которого будут представлены взаимно усиливающие изменения в деловой практике и базовых информационных технологиях. Универсальная коммерция — это обмен деловой информацией, поддержание деловых отношений и проведение деловых операций любыми способами (традиционными средствами и посредством телекоммуникационных сетей). В сегодняшней деловой среде, где операционные границы между фирмами стали плавными, непродуктивно отделять межорганизационные бизнес-процессы от внутриорганизационных.

Рекомендуемое цитирование

Грикар, Хосе; Бракун, Франк; Козель, Станко; Еловкан, Милан; Петрич, Дарджан; Силиконовый, Марин; и Зерко, Иван, «Проблемы развития информационных систем в стране, готовящейся к вступлению в Европейский Союз — Группа экспертов по Словении» (2001). ECIS 2001 Proceedings . 46.
https://aisel.aisnet.org/ecis2001/46

Темная красавица: Дуэт мамы и дочери Шерил и Келси Бэрд занимается конным бизнесом, но не просто четвероногим рысаком.Они заботятся о редкой породе, называемой фризской, — с гривой, как у рокеров 80-х, и телосложением, как у олимпийских спортсменов, — и объединяют этих конных подопечных со своими идеальными хозяевами.

Облако пыли поднимается, когда тяжелые копыта тревожат сухую местность. Черная, как обсидиан, лошадь делает свой круг на ринге — локомотив элегантной силы, по-видимому, не подозревая о своем весе почти в 1400 фунтов. Будь это пятнадцатый век, всадник, одетый во все черное, за исключением светлых волос, с таким же успехом мог бы быть рыцарем в кольчуге.Скорее, это просто еще один день на ферме Friesian Marketplace в Грире, Южная Каролина.

Келси Бэрд сидит на лошади по имени Ник, которую скоро отправят в его новый дом в Орегоне. Ник — как и его товарищи-фризы, Корнил, Кинг и Люк, если назвать некоторых, — всего лишь одна из лошадей, которых Келси, ее мать и деловой партнер Шерил импортировали из Голландии. За последние девять лет дуэт нашел идеальные дома для этих уникальных лошадей — от Австралии до Нэшвилла, Канады и Мексики, и да, даже чуть дальше по улице, где клиенту принадлежат шесть фризов.Это похоже на бизнес-историю, но с животными, особенно с лошадьми и их владельцами, все всегда гораздо более личным. Это то, что Шерил называет «сердечным делом», и они «сваты» — спаривают нужную лошадь с нужным владельцем.

Кто эти владельцы? Посмотрим, у Бэрдс были запросы от Марты Стюарт (ее агента), шейха из Дубая (его «парень») и участника группы Bon Jovi. (Из них пианист Бон Джови купил один для своей жены). Клиенты, которые пишут и зовут Бэрдс с пылкой благодарностью и сообщают новости о своей лошади через несколько лет после покупки, приходят отовсюду и из любого спектра.Менеджер кантри-шоу Big & Rich Марк Освальд и его жена Криста купили две лошади, одна из которых будет лошадью для гостей в особняке Фонтанел, бывшем доме кантри-звезды Барбары Мандрелл в Нэшвилле, который теперь принадлежит Освальдам. . Кроме того, есть оригинальный создатель продукта Simple Green, Джуди Уокер из Калифорнии, которая купила его для своей внучки Лорен, с которой Келси провела неделю на тренировках на Западном побережье.

Один из шести оригинальных фризов, купленных Бэрдами почти десять лет назад во время их первой поездки в Голландию, вызвал интерес у женщины по имени Блайт Браун из Нью-Гэмпшира.«Она рассказала мне о Зерко (зарегистрированное голландское имя лошади), — вспоминает Браун, — и после долгого разговора мы решили, что Зерко мне подойдет. Я полетел в Южную Каролину, чтобы встретить своего возможного нового компаньона на коне, и это была любовь с первого взгляда. Зерко приехал на нашу ферму в Нью-Гэмпшире, и тут же этот фризиец украл мое сердце. Я сменила его имя и дала сараю имя «Данте» — кончик шляпы для персонажа нового романа, который писал мой муж ».

Этот роман — Inferno Дэна Брауна, написанный через 10 лет после его блокбастера The DaVinci Code .У Данте, то есть лошади, теперь есть свой фан-клуб, и он украшает дверь сарая скульптурой на ферме Брауна, Исторический Раннимид, в Нью-Гэмпшире.

По своей природе величественные лошади обладают особенно сильной хваткой. Не ищите ничего, кроме Black Beauty, , написанного в 1877 году британской писательницей Анной Сьюэлл. Спустя более ста лет эта книга до сих пор остается одной из самых успешных из когда-либо изданных. И это про лошадь. Не фриз, заметьте, но все же лошадь. Но, как вам скажет любой фризский владелец, это не просто лошадь.

Отличительными чертами фризской породы, происходящей из Фрисландии на северо-западе Нидерландов, являются оперение на лапах, которое придает изящную деталь этим в остальном крупнокостным, широким колоссам, а также их длинные распущенные гривы и блестящие черные волосы. как полуночные пальто. Они нежны и уравновешены; конь знати — действительно, рыцарей в сияющих доспехах. Пока, как это было с тенденциями, фризы не превратились в упряжных лошадей для сельскохозяйственных целей, особенно во Фрисландии, где от этого зависела экономика.Фактически, лошадь почти полностью исчезла. «Они снова заставили породу развиваться, и они начали больше совершенствовать породу и делать ее более современной для спорта, — объясняет Шерил, которая начала заниматься верховой ездой в возрасте 6 лет и тренировала лошадей 35 лет, — и теперь они выглядят более спортивными, чем в других странах. старые времена, когда они были шире и толще для тяги ».

Конечно, как и в большинстве историй успеха, если бы не случайная встреча с Фриизаном, которого друг привел к Шерил на тренировку, это могла бы быть любая другая история про лошадей.Вместо этого «это была самая умная и опрятная лошадь, с которой я когда-либо работала, и я ничего о них не знала», — говорит Черил, сидя у камина в своем доме рядом с сараем. «Я сказал:« Я попробую ». Ему было три года, и поначалу он был немного сумасшедшим, поэтому я взял его, и оказалось, что я выиграл с ним пять титулов чемпиона мира».

«Однажды я вышел из сарая и сказал:« Однажды мы все будем черными. У нас будут все черные фризы ». И моя мечта сбылась. Вначале это было действительно тяжело, потому что мне пришлось ехать по менее путешествующей дороге, о которой я действительно мало что знал.Но мне потребовалось много времени, чтобы узнать о фризах, и мне это очень понравилось, так что это сделало это намного проще ».

Та самая лошадь по имени Маверик даже подходила, когда она кричала. У нее был свой момент в горячем месте с ним, когда Маверик должен был появиться в бейсбольном фильме Клинта Иствуда 2012 года, Проблемы с кривой . «Ему пришлось бежать по бейсбольному полю в Атланте, — говорит Шерил, — без недоуздка на полном скаку, и все киношники стояли прямо за мной, спрашивая:« Он это сделает? »Они отпустили его, и он кончил прямо к моим ногам, и все приветствовали.”

Если она звучит как гордая мама, так и есть. Хотя трудно сказать, гордится ли она больше своей дочерью (студентка Биоинженерии Клемсон, получившая стипендию, получившая степень магистра в 21 год), или успехом, которого они достигли вместе как динамичный дуэт, решивший начать онлайн-бизнес. бизнес по импорту лошадей из Голландии, которая в настоящее время является крупнейшим импортером Восточного побережья.

Шерил и Келси пытаются посетить Голландию три раза в год, и будут там в этом месяце. Они продают лошадей в количестве примерно трех штук в месяц, хотя в прошлом году они продали 50, что на сегодняшний день является самой большой суммой.Ник, лошадь, направляющаяся в Орегон, супермодель среди лошадей за его тренированность и красоту, является одной из самых продаваемых — 45000 долларов. Будь он моложе, он мог бы получить до 150 000 долларов. Деловой партнер Бэрдс из Голландии помогает им решить, какие лошади приезжают в Штаты — только лучшие, поскольку репутация Бэрдс блестящая, как угольно-черные мундиры их подопечных.

Лошади проделывают долгий путь из Амстердама в Нью-Йорк. «У каждой есть свой личный конюх, чтобы им было комфортно во время полета», — говорит Черил, затем добавляет, смеясь, «Ну, знаете, чтобы достать им коктейли или что-нибудь в этом роде.«Мерины остаются на карантине три дня, кобылы — две недели, а жеребцы — месяц. Оттуда мы отправимся в Орегон, Оклахому или Нью-Джерси (естественно, Бон Джови), путешествуя такими компаниями, как Horses2Fly, или в стойле, загруженном на большую грузовую платформу. Но это не раньше, чем их приветствуют, как нового члена семьи, на 10-акровой ферме Friesian Marketplace, удобно расположенной в десяти минутах от аэропорта.

«Обычно они приезжают в 2 или 3 часа ночи, и мы всегда в восторге», — говорит Шерил.«Каждый раз это как рождение ребенка. Они выходят из трейлера с ясными глазами, типа «Где мы? Это не Голландия! »Я угощаю их угощениями и устраиваю их поудобнее. Я сделаю им морковно-сладкий картофельный картофель, мы поцеловаем их и дадим им немного поспать, потому что они устали от поездки ».

Каждый студент колледжа, возвращающийся домой на весенние каникулы, должен быть таким удачливым. Но эти лошади и их отношения так много значат для этих двух женщин — в смысле того, что они значат для своих клиентов.Знаменитые и не очень известные люди находят дружбу, утешение и даже терапию в своем фризском языке, например, справляться с медленным уходом мужа от БАС, или с сокрушительным одиночеством после того, как они проходят, или добавляя большой всплеск черный к золотым годам, как один муж удивил свою жену. Темно-карие глаза Шерил сверкают, рассказывая историю. «Мы только что отправили лошадь в Вирджинию», — говорит она. «Этот человек приказал прийти всем церковным дамам по соседству, и его жена не знала.Подъехал трейлер, и он сказал: «У меня твоя новая лошадь!» »Как доброжелательный друг, устраивающий свидание вслепую, Шерил надеется, что это всегда будет идеальная пара. «Вы просто надеетесь, что все пойдет правильно», — говорит Шерил. «Для наших клиентов — и для наших лошадей. Важно, чтобы у них были нужные люди ».

Для Дебби Кеслинг из Огайо лошадь по имени Занзибар определенно была правильным выбором. Муж Кеслинг скончался от БАС, но не раньше, чем он получил лошадь своей мечты. «Он сказал одной женщине в сарае, что он рад, что у меня будет Занзибар, когда его больше не будет», — говорит Кеслинг.«Зан стала моей терапевтической лошадкой. Я могу сказать ему все, что угодно, и он не против слез, которые иногда идут вместе с этим ».

Бэрдс зарабатывают на жизнь своим любимым делом, воплощая в жизнь мечты людей, которые любят фризов так же сильно, как и они сами. Даже если это тяжелая работа семь дней в неделю. Мать Шерил, Кэролайн, которой за 70, даже помогает вести бухгалтерию и убирать прилавки. Постоянный уход, обслуживание и уход. У Бэрдов иного не было бы. «Вначале у вас есть действительно хорошая идея, но вы действительно не знаете, как она будет развиваться, пока не начнете делать это и не выясните, что работает, а что нет», — говорит Шерил.Но, как теперь знают Бэрдс, стремление к своей мечте — каким бы масштабным (в буквальном смысле) это мероприятие ни было — всегда будет выделять вас из породы.

есть вера — Польский перевод — Linguee

Есть веры w i th в польском правовом […]

сообщества, что, если предложенная структура вознаграждения будет реализована, юрисконсульты и

[…]

адвоката, чтобы оставаться в бизнесе, будут искать творческие средства, чтобы обойти установленный лимит на их гонорары.

ccbe.eu

Istnie je przekonanie w po lski m ś ro dowisku […]

prawniczym, że jeżeli proponowana Struktura wynagrodzeń zostanie wdroona, w celu

[…]

kontynuowania działalności radcy prawni i adwokaci będą szukać kreatywnych sposobów obejścia nałożonych limitów.

ccbe.eu

Howe ve r , есть a вер t га t есть s h или ld будет сбалансированным подходом с некоторым сокращением индивидуальных […]

платежа и некоторое увеличение налога.

эгон.com

J ednak że panu je przekonanie, i ż tow arzy sz yć podejście do pro bl emu emerytur pow in no być zr noważone, polegające […]

на пивных редукторах

[…]

świadczeń i jakimś wzroście opodatkowania.

aegon.pl

Род ll y , есть a вера t h при правильно выполненная СЛР действительно оказывает существенное влияние на выживаемость [6].

allegro.cartelcolor.com

O gól nie funkcjonuj e przekonanie, że aśc iw ie wykonana RKO posiada istotny wp ływ na na na ].

allegro.cartelcolor.com

В Christia ni t y есть a вера i n t первородный грех.

islamicinformationcenter.info

W chrześcijaństwi e jest wiara w grz echu pi erworodnego.

islamicinformationcenter.info

Есть веры t h на Европейский Союз […]

может работать лучше, чем отдельные государства-члены, и это, безусловно, твердое убеждение. […]

в государстве-члене, которое я представляю, Ирландии, где мы находимся в разгаре экономического и банковского кризиса, который требует глубокого анализа и тщательного изучения.

europarl.europa.eu

Istni eje przekonanie, ż e Unia Eur op ejska poradzi […]

sobie lepiej niż poszczególne państwa członkowskie i zdecydowanie takie

[…]

silne przekonanie występuje w репрезентованым przeze mnie państwie, czyli w Irlandii, znajdującym się w głębokim kryzysie gospodarczym i bankowym, który wymaga dogłębneania analiz.

europarl.europa.eu

(PT) Это положительно th a t есть a вер t h at ‘Платежи LFA должны [… ]

быть связано с активным земледелием »и что« строго и чисто

[…]

биофизических критериев могут не подходить ».

europarl.europa.eu

(PT) Pozytywnym zjawi sk iem jest , że i stn iej e przekonanie, pła tn ości dla […]

obszaró w o mniej k или zystnych warunkach gospodarowania powinny

[…]

zostać powiązane z aktywną uprawą roli ”, a także, że„ surowe i wyłącznie biofizyczne kryteria mogą nie być odpowiednie ”.

europarl.europa.eu

Комиссия также признает, что существование крупных

[…]

схем, финансируемых банками, привлекает

[…] проблема «морального риска» s i f есть a вера t h at такие средства существуют для […]

защищает банки от сбоев в будущем.

europa.eu

Komisja uznaje również fakt, iż tworzenie wielkich funduszy finansowanych przez banki

[…]

prowadzi do pokusy

[…] nadużycia, wyni ka jąc ej z pr ześ wi adczeni a że c ele m funduszu j est bezw ar unkowa [ unkowa] ]

ochrona banków przed niewypłacalnością.

europa.eu

Moreo ve r , есть a вер t h на куплены сувениры […]

в Иерусалиме, а ведь на производстве здесь работают целые семьи

[…]

сувенира из оливкового дерева на память о родных.

воскресенье. Niedziela.pl

Do teg o doch odz i przekonanie, że pa miąt ki kupuje […]

się w Jerozolimie, a przecież całe rodziny pracują tu przy wyrobach z drzewa

[…]

oliwnego, żeby utrzymać swoich najbliższych.

воскресенье.niedziela.pl

Есть веры t h на , если у нас нет зон, это будет почти […]

будет оскорблением внутреннего рынка.

europarl.europa.eu

Istn iej e przekonanie, że je eli ni e wprowadzimy s tref, b ędzie to […]

nieomal obelgą dla rynku wewnętrznego.

europarl.europa.eu

Знания ограничены, b u t есть a вера .

people-changed-world.com

Wiedza czytuje

[…] ograni cz ona, ale zato to jest wiara .

people-changed-world.com

Уильям Джеймс сказал правду о

[…] идея верна как lon g a s есть a вер i t i s выгодно для нашей жизни.

meta-biel.insitu.pl

W. James mówic o prawdzie idei, mówił, że jest ona tak długo

[…] prawdziw a, jak d łu go istnieje pr zek onani e, że jes t ona k or zystna [… ]

dla naszego ycia.

meta-biel.insitu.pl

Где ev e r , есть a уверенность t h at гибкость удовлетворяет интересы штатного персонала […]

, чем при строгом разграничении

[…]

(например, политика «только для сотрудников, работающих на полную ставку»).

ctue-project.org

P r ocedu ra ta zn ajdzie za stosowanie w szęd zie tam, gd ie stjn e przekonanie, że ud ział z atrudnionego […]

na stałe personelu

[…]

daje lepsze wyniki przy elastycznej niż przy surowej demokracji (takiej jak polityka oparta na zasadzie «tylko pracownicy w pełnym wymiarze godzin»).

ctue-project.org

Среди верующих в России и среди доминиканцев

[…] Сестры в По la n d есть a вера i n t святость старшего

en.catholicmartyrs.org

Wsród wiernych w Rosji i

[…] Domini ka nek w Pol sce istnieje prz eko nanie o świętości […]

с. Róży Serca Maryi i o jej męczeństwie.

pl.catholicmartyrs.org

Однако вместе с подходами, которые могут быть

[…]

называется прагматичным или

[…] реалистично, в этом Parlia me n t есть i n cr ea si n g уверенность i n t идея, что те […]

партнеров, с которыми мы

[…]

хотят очень тесных связей, должны вести себя в соответствии с международным правом и уважать основные права и свободы, особенно если они являются партнерами, принадлежащими к большой европейской семье.

europarl.europa.eu

Jednak oprócz podejścia nazywanego

[…]

прагматическим луб

[…] realistycznym w ty m Parla men cie narasta przekonanie, ż e p artne rz y, z kt or ymi chcemy […]

ścisłych powizań,

[…]

muszą postępować zgodnie z prawem międzynarodowym i mieć poszanowanie dla podstawowych praw i wolności, zwłaszcza jeśli są to partnerzy należący do wielkiej rodziny europejskiej.

europarl.europa.eu

l так вера t h на пожилых людей, на сегодняшнем быстро развивающемся рынке труда, […]

быстро становятся неконкурентоспособными по сравнению с

[…]

социально активных, амбициозных и открытых к новым вызовам молодых людей.

voip-проект.eu

Istniej e t eż przekonanie, iż o sob y st ar s ze na dzisiejszym, dy na micznie […]

rozwijajcym się rynku pracy, bardzo szybko staj

[…]

się niekonkurencyjne w porównaniu do społecznie aktywnych, ambitnych и otwartych na nowe wyzwania młodych ludzi.

voip-project.eu

Ind ee d , есть a wi desp re a d trust t h у только крупнее […]

учреждения могут гарантировать такие объекты, как бассейн

[…]

или ежедневное присутствие врача-специалиста.

esn-eu.org

W ie le os ób wierzy, ż e tyl ko duże ośrodki mogą zapewnić […]

нп. nieskrępowany dostęp do basenu czy specjalistycznej opieki medycznej.

esn-eu.org

Есть wi d e вера a m на г иностранцев, что немецкий очень похож на […]

Английский, поэтому некоторые люди думают, что если они говорят на

[…]

Английский язык они смогут выучить немецкий быстро.

justlanded.com

Wśród obcok ra jowcó w powszechna jest wiara, że niemiecki jest bardz o подобный […]

do angielskiego, a więc znając angielski, nauka

[…]

niemieckiego jest już igraszką.

justlanded.com

Существует ne ed для развития уверенности в себе и se l f веры a m на gst people [ …]

инвалиды, имеющие право руководить

[…]

а реализованные жизни как ценные личности.

артерипроект.eu

Należy roz wijać p ewność siebie i wiarę w siebie u osób n iepełnosprawnych, które […]

mają prawo spełnić się w życiu jako wartościowe jednostki.

arteryproject.eu

Есть a ve ry lim it e d вер i n t he state […]

для обеспечения пенсии по сравнению с остальной Европой.

media.swissre.com

Bardzo o grani czo na wiara , ż e pańs tw o zapewni […]

emeryturę w porównaniu do reszty Europy.

media.swissre.com

Весь t ru t h is o n e alth ou g h есть m a ny Diffe re n t вер p r из файлов.

islamicinformationcenter.info

C ap rawd a jest j edny m, c ho ciaż istnieje w iele ró на ych wierzeń pro fil i .

islamicinformationcenter.info

Не все

[…] что на самом деле производит e m y верование t ha t есть a ho rse передо мной должен […]

вызывают это убеждение:

[…]

осла, который находится передо мной и фактически вызывает мою веру, не должен этого делать.

avant.edu.pl

Nie w sz ystko bow ie m co f ak tycznie tw orzy moj e przekonanie, że stoi przed e mną koń, […]

powinno je tworzyć: osioł stojcy przede

[…]

mną, który rzeczywiście kauzalnie tworzy moje przekonanie [точка. кониа — прзып. tłum.

avant.edu.pl

Есть wi , и ясно оправдать , то есть d , вера t h at Польша [… ]

теперь сталкивается с уникальной экономической проблемой и возможностью,

[…]

в отличие от всего, что он испытывал за последние годы

konferencje.orlen.pl

Istnieje pows ​​ zechne i uzasadnione — p rze konanie, że Polska staje […]

obecnie przed gospodarczym wyzwaniem i szansą, jakie

[…]

od dawna nie były jej udziałem.

konferencje.orlen.pl

Вышеупомянутая экстраполяция эмпирического принципа поведения Бога имеет довольно плохие последствия для так называемых «атеистов». Это потому, что это означает, что для людей, которые при жизни являются атеистами

[…]

и которые твердо уверены, что после

[…] физический d ea t h есть N O любая форма жизни, фактически t he i r вера b e в г. Выполнено.

rex.dasfree.com

ateistów «. Oznacza ona bowiem, że dla osób które za ycia są

[…]

ateistami i które silnie wierz że p o

[…] śmierci f iz yczne j NIE i stnieje już adne ż yci e, faktycznie wypełnia się to w co wierzą.

rex.dasfree.com

Допускается PRAMAC

[…] раскрывать личную информацию только в том случае, если это предусмотрено законом или в ca s e есть t h e fi r m уверенность t h at такое действие необходимо для (а) соблюдения закона или соответствия […]

к положениям

[…]

нормативного правового акта с участием PRAMAC или Сайта; (b) защиты прав или собственности PRAMAC; o (c) действий в экстремальных обстоятельствах для защиты личной безопасности сотрудников PRAMAC, пользователей продуктов или услуг PRAMAC или общества.

pramac-lifter.com

Фирма PRAMAC ma p rawo ujawnić dane o sobowe tylko wtedy, gdy zostanie do tego zobowiązana przez prawo lub w przypadk u, gdy niezek e dzi ałan ie takie jest […]

konieczne dla (a) wypełnienia

[…]

prawa lub postępowania zgodnego z przepisami aktu prawnego z udziałem firmy PRAMAC lub Strony; (b) ochrony praw własności firmy PRAMAC, lub (c) działania w warunkach ekstremalnych w celu ochrony bezpieczeństwa pracowników firmy PRAMAC, użytkowników produktów i usług firmy PRAMAC uytóg.

pramac-lifter.com

2.1.4.2 Тем не менее, вопреки нормам мм o n уверенность , , существует g r ea t возможности для повышения энергоэффективности, существующие как хорошо […]

как новостройки, в частности

[…]

в многоквартирном доме в городах (6).

eur-lex.europa.eu

2.1.4.2 Wbrew po WS zechn ej opinii istnieją bowi em z na czne możliwości zwiększenia efektywności energet yc znej znej […]

нович, lecz równie istniejących,

[…]

a przede wszystkim wielorodzinnych budynków mieszkalnych znajdujących się w dużych miastach (6).

eur-lex.europa.eu

Итак, из-за наших ограниченных знаний и из-за очевидной необходимости иметь представление

[…]

про невидимое

[…] люди имеют различие re n t верование p r из файлов: среди t ho s e есть s o мне кто очень заботится […]

Немного о невидимом

[…]

и верьте и наслаждайтесь видимым, каким оно есть.

islamicinformationcenter.info

Tak, z powodu naszych ograniczeń wiedzy

[…]

i widocznej trzeba mieć

[…] pojęcie o niewi dzi aln ym ludzie ma żne p rzeko na nia профиль : wś d tych ró […]

są tacy, którzy dbać

[…]

bardzo mało o skryte i wierzą w i cieszyć się widoczne jak to jest.

islamicinformationcenter.info

Для сохранения баланса возможностей трудоустройства учителей в Северной Ирландии, в то время как

[…]

в целях согласования

[…] историческое разделение между основными религиозными общинами ti e s там , t he Положения о религии n o r вера i n t Его Директива не применяется к набору учителей в школах Северной Ирландии, поскольку th i s is e x pr , что разрешено национальным законодательством.

Добавить комментарий

Ваш адрес email не будет опубликован. Обязательные поля помечены *