Что означает зе рко: РКО для ИП и ООО – что это такое

1.1 Вопрос о том, что истцы или заявители должны предоставить обеспечение судебных издержек или апелляций, всегда вызывал сложные вопросы. Однако в тяжелые финансовые времена таким вопросам уделяется гораздо больше внимания.На таком фоне стороны по понятным причинам обеспокоены участием в дорогостоящих судебных тяжбах только для того, чтобы обнаружить, что, несмотря на успех в рассматриваемом судебном разбирательстве, их оппонент не в состоянии покрыть компенсацию расходов, которые обычно следовали бы. С другой стороны, истцы и апеллянты по понятным причинам обеспокоены тем, что их обычное право возбуждать и возбуждать судебное разбирательство или обжаловать неблагоприятные решения может быть существенно ограничено, если от них потребуют внести значительные суммы денег в качестве платы за судебное разбирательство.

1.2 Этот суд недавно, в деле Фаррелл против Банка Ирландии [2012] IESC 42, должен был рассмотреть юрисдикцию для присуждения обеспечения для покрытия расходов на апелляцию. Решение по этому делу также предоставляет некоторый анализ общих принципов со ссылкой на то, какие меры безопасности могут быть заказаны. Однако, как указано в Farrell, , по крайней мере, в некоторых отношениях применяются разные соображения в отношении обеспечения расходов по еще неурегулированному иску, с одной стороны, и апелляции против неблагоприятного заключения, с другой стороны.Точно так же существуют различия между обеспечением, предоставленным компаниям с ограниченной ответственностью, с одной стороны, и физическим лицам, с другой.

1.3 Действительно, в основе этой апелляции лежит позиция юридического лица (хотя и не компании с ограниченной ответственностью). Истец / ответчик («Мавиор») — зарегистрированная в Ирландии компания с неограниченной ответственностью. Он возбуждает это судебное разбирательство с требованием денежных сумм, которые, как утверждалось, причитаются с ответчика / истца («Зерко») либо на основании контракта, либо на основе квоты квантовых мер , возникающих в результате строительных работ, связанных с существенным ремонтом, который должен быть перенесено в здание отеля в Дублине, поврежденное штормом.Зерко категорически возражает против этих требований. Действительно, Зерко заходит так далеко, что заявляет, что у него нет договорных или юридических отношений с Мавиором, которые позволили бы Мавиору поддерживать какие-либо претензии к нему. В этих обстоятельствах Зерко требовал обеспечения расходов на судебное разбирательство против Мавиора. Дело было передано в Высокий суд (Finlay Geoghegan J. ) и стало предметом постановления от 22 ^и ноября 2012 г. ( Mavior v. Zerko Limited [2012] IEHC 471). Вынося это суждение, Финли Геогеган Дж.отклонил ходатайство Зерко о возмещении расходов. Зерко обжаловал этот отказ в этом суде. Уместно начать с краткого изложения соответствующих исходных фактов.

2.1 В обстоятельствах, которые не являются существенными для узкого вопроса, который сейчас должен рассмотреть этот Суд, Zerko, который, по всей видимости, является специализированной структурой, учрежденной Ulster Bank Ireland Limited для целей владения долей участия в банковском синдикате в Ballsbridge Inns и Tower Hotels в Дублине заключили соглашение с MJBCH Limited в целях управления этими отелями.MJBCH Limited — компания, контролируемая господином Шоном Данном. Между MJBCH Limited и Mavior существует связь, поскольку, по-видимому, принято считать, что вся бенефициарная доля в Mavior в конечном итоге принадлежит г-же Гейл Киллилеа. Мисс Киллилея замужем за мистером Шоном Данном.

2.2 Утверждается, что в результате урагана было заключено соглашение между Zerko и MJBCH Limited о том, что последняя организует ремонт и восстановительные работы, которые будут выполнены.Также утверждается, что MJBCH заключила соглашение с Mavior на выполнение некоторых из соответствующих работ. Утверждается, что MJBCH имел полномочия, как агент Зерко, заключать соглашение с Mavior и, следовательно, Zerko несет ответственность перед Mavior по оплате в соответствии с этим контрактом. В качестве альтернативы, как уже указывалось, Mavior требует денег, которые, как утверждалось, причитались ему Зерко на основе квантового эквивалента в счет стоимости таких строительных работ, которые, как утверждается, были выполнены по запросу Зерко и с ведома Зерко.

2.3 Zerko оспаривает условия предполагаемого соглашения между ним и MJBCH Limited, а также наличие какого-либо контракта между ним и Mavior. Хотя Зерко не оспаривает, что Мавиор выполнял работы в отелях, от которых он теперь получает прибыль, Зерко утверждает, что некоторые из работ не соответствовали стандартам. Зерко также говорит, что договоренности между …

Комбинация TRAIL длительного действия и фотодинамической терапии, нацеленной на опухолевые клетки, как новая стратегия преодоления химиотерапевтической множественной лекарственной устойчивости и TRAIL-резистентности колоректального рака

Резюме

Химиотерапевтическая множественная лекарственная устойчивость (МЛУ) является основным препятствием для клинической терапии колоректального рака (CRC).Лиганд, индуцирующий апоптоз, связанный с фактором некроза опухоли (TRAIL), обладающий избирательной цитотоксичностью, может преодолевать МЛУ клеток CRC. К сожалению, перекрестная резистентность к TRAIL была обнаружена во многих клетках CRC, что указывает на необходимость комбинирования TRAIL с сенсибилизаторами для борьбы с рефрактерным CRC. Наша цель — изучить потенциал комбинированной терапии TRAIL и направленной на опухолевые клетки фотодинамической терапии (PDT) в борьбе с CRC с химиотерапевтическим MDR и резистентностью к TRAIL.

Методы: ФДТ, нацеленная на опухолевые клетки, выполнялась с использованием фотосенсибилизатора Ze-IR700 с высоким сродством к рецептору эпидермального фактора роста (EGFR).Влияние ФДТ на экспрессию генов клеток CRC было выявлено путем секвенирования РНК. Синергетический противоопухолевый эффект TRAIL и PDT длительного действия был оценен на мышах, несущих опухолевые трансплантаты клеток CRC с химиотерапевтической устойчивостью к MDR и TRAIL.

Результаты: Химиотерапевтическая резистентность к МЛУ и TRAIL является обычным явлением для клеток CRC. Предварительная обработка клеток CRC ФДТ, нацеленной на опухолевые клетки, значительно (в 10-60 раз) увеличивала чувствительность этих клеток CRC к TRAIL за счет активации рецепторов смерти.Комбинированная терапия, но не монотерапия, TRAIL и PDT длительного действия в значительной степени индуцировала апоптоз клеток CRC, таким образом, эффективно уничтожая большие (~ 150 мм ³ ) ксенотрансплантаты опухоли CRC у мышей.

Выводы: ФДТ, нацеленная на опухолевые клетки, сильно сенсибилизирует клетки CRC к TRAIL. Комбинированная терапия TRAIL длительного действия и ФДТ является многообещающей для борьбы с CRC как с химиотерапевтической МЛУ, так и с резистентностью к TRAIL, что может быть разработано как новая стратегия точной терапии рефрактерной CRC.

Ключевые слова: Лиганд, индуцирующий апоптоз, связанный с фактором некроза опухоли, фотодинамическая терапия, множественная лекарственная устойчивость, таргетная терапия рака, колоректальный рак.

Введение

Колоректальный рак (CRC) является одним из наиболее распространенных видов рака и занимает второе место среди причин смерти от рака в мире в 2019 году ¹ . Обычная химиотерапия была основной адъювантной терапевтической стратегией при CRC в последние десятилетия. Недавно были идентифицированы многочисленные химические вещества, нацеленные на сигнальные пути, опосредованные рецептором эпидермального фактора роста (EGFR) или рецептором фактора роста эндотелия сосудов (VEGFR), что обеспечивает новые альтернативы терапии CRC ² . Однако белки химического оттока, , т.е. , переносчики АТФ-связывающей кассеты (ABC), повсеместно экспрессируются в энтероцитах ^{3 , 4} , что облегчает выработку клетками CRC химиотерапевтической множественной лекарственной устойчивости (MDR). ) как для обычных химиотерапевтических средств, так и для новых химикатов молекулярного таргетинга ⁵ . Из-за различий в механизмах проникновения и действия в клетки макромолекулярные белки, такие как моноклональные антитела против EGFR, могут обходить путь МЛУ для небольших химических препаратов.Однако гетерогенные мутации в генах, таких как KRAS, NRAS и BRAF, вызывают устойчивость CRC к лечению анти-EGFR ⁶ . Несмотря на быстрый прогресс терапевтических стратегий, перспективы заболеваемости CRC мрачны. Количество новых случаев CRC составило примерно 1,8 миллиона в 2018 году, но глобальное бремя CRC может увеличиться до 60% к 2030 году ¹ . Очевидно, что для точной терапии CRC с химиотерапевтическим МЛУ срочно требуются инновационные терапевтические стратегии.

Апоптоз — важный механизм гемеостаза. Лиганд, индуцирующий апоптоз, связанный с фактором некроза опухоли (TRAIL), мощный индуктор апоптоза, отображаемый на поверхности NK-клеток и цитотоксических Т-клеток, играет важную роль в защите опухоли ⁷ . Рекомбинантный растворимый TRAIL является привлекательным в качестве противоопухолевого агента из-за его селективной индукции апоптоза в опухолевых клетках, сверхэкспрессирующих рецепторы TRAIL (рецептор смерти 4, DR4 и рецептор смерти 5, DR5) без системной токсичности.Хотя MDR является обычным явлением для CRC, рекомбинантный TRAIL проявляет сильную цитотоксичность в многочисленных клетках CRC ⁸ , что предполагает потенциал TRAIL для преодоления MDR CRC. Однако противоопухолевый эффект in vivo TRAIL далек от удовлетворительного, что в основном объяснялось ограниченным поглощением опухолью в результате плохого нацеливания на опухоль, а также коротким периодом полужизни TRAIL ⁹ в сыворотке. В последние годы были предприняты большие усилия для улучшения фармакокинетики TRAIL ^{10 — 13} , что значительно усилило противоопухолевый эффект TRAIL в отношении различных раковых клеток.Однако многие клетки CRC все еще устойчивы к этим модифицированным форматам TRAIL ⁸ , что указывает на необходимость комбинации TRAIL с сенсибилизатором опухолевых клеток для преодоления химиотерапевтической устойчивости к MDR и TRAIL. Фактически, предварительная обработка некоторыми химическими препаратами определенно сенсибилизировала клетки CRC к TRAIL за счет активации рецепторов смерти и / или подавления антиапоптотических белков ^{14 , 15} . Однако комбинация TRAIL и химиотерапевтических средств не показала многообещающего синергетического противоопухолевого эффекта у пациентов с CRC ¹⁶ .С одной стороны, большинство химических веществ в сочетании с TRAIL неспецифически токсичны для клеток. Чтобы избежать системной токсичности, эти неспецифические химические вещества следует вводить в низких дозах, которые не могут эффективно сенсибилизировать опухолевые клетки. С другой стороны, фармакокинетика TRAIL и небольших химических веществ определенно различается. Поскольку химические вещества требуют много времени для индукции экспрессии рецептора смерти в опухолевых клетках, короткий период полужизни в сыворотке ограничивает TRAIL уничтожением опухолевых клеток, предварительно сенсибилизированных химическими веществами.Следовательно, комбинация TRAIL длительного действия и терапевтического средства, которое будет избирательно действовать на опухолевые клетки, может оказывать многообещающий синергетический противоопухолевый эффект без системной токсичности.

Интересно, что было обнаружено, что избыточные активные формы кислорода (АФК) могут сенсибилизировать клетки CRC к TRAIL за счет активации рецепторов смерти и / или подавления антиапоптотических белков ¹⁷ . Фотодинамическая терапия (ФДТ) эффективна в производстве АФК путем активации фотосенсибилизатора в клетках с помощью лазерного света ^{18 , 19} . Фактически, предварительные исследования показали, что PDT индуцирует экспрессию рецептора смерти в некоторых раковых клетках, продуцируя ROS ^{20 , 21} , что позволяет предположить, что PDT может синергетически взаимодействовать с TRAIL в уничтожении клеток CRC с химиотерапевтической MDR и резистентностью к TRAIL. Кроме того, из-за задействованных уникальных механизмов, включая индукцию апоптоза, а также повреждение транспортеров ABC, ФДТ считалась потенциальной стратегией преодоления МЛУ рака ^{22 , 23} .Примечательно, что PDT достигается за счет запуска поглощения фотосенсибилизатора клетками с использованием лазерного света с определенной длиной волны. Из-за короткого срока жизни и ограниченного расстояния диффузии ROS фототоксичность, вызванная PDT, была ограничена клетками, поглощающими фотосенсибилизаторы, и облученными лазерным светом. После того, как фотосенсибилизаторы были конъюгированы с носителем, возвращающим опухоль, фототоксичность ФДТ может быть дополнительно сфокусирована на опухолевых клетках ²⁴ , что способствует точности и биобезопасности ФДТ в терапии рака. Фактически, PDT была одобрена для лечения различных солидных опухолей, включая CRC ²⁵ . Потенциальный синергизм между PDT и TRAIL в уничтожении клеток CRC и клиническая биобезопасность как PDT, так и TRAIL сильно вызвали наш интерес к оценке эффекта их комбинации в борьбе с CRC с химиотерапевтической MDR и TRAIL-устойчивостью.

Поскольку рецептор эпидермального фактора роста (EGFR) сверхэкспрессируется в большинстве клеток CRC с MDR, мы попытались провести ФДТ, нацеленную на опухолевые клетки, путем доставки фотосенсибилизаторов в клетки CRC с использованием аффибоди Z _EGFR , которое имеет высокую специфичность и сродство к EGFR ^{26 , 27} .Впоследствии мы определили молекулярную основу синергизма между PDT, нацеленной на опухолевые клетки, и TRAIL в уничтожении клеток CRC. Наконец, мы исследовали синергетический противоопухолевый эффект ФДТ, нацеленной на опухолевые клетки, и варианта TRAIL длительного действия, , т. е. , IgBD-TRAIL, который мог связывать эндогенный IgG ²⁸ у мышей, несущих опухолевые трансплантаты клеток CRC с химиотерапевтическим MDR и TRAIL сопротивление. Наши результаты показали, что ФДТ, нацеленная на опухолевые клетки, сильно сенсибилизировала клетки CRC с множественной лекарственной устойчивостью к TRAIL, активируя как DR4, так и DR5.Кроме того, комбинация IgBD-TRAIL длительного действия, но не TRAIL с коротким периодом полувыведения из сыворотки, и ФДТ, нацеленная на опухолевые клетки, эффективно уничтожала большие (~ 150 мм ³ ) опухолевые трансплантаты клеток CRC с химиотерапевтическим МЛУ и TRAIL. резистентность, предполагая, что комбинированная терапия TRAIL длительного действия и ФДТ, нацеленная на опухолевые клетки, может быть новой стратегией для борьбы с рефрактерным CRC.

Материалы и методы

Получение и характеристика аффибоди Ze

Ген, кодирующий аффибоди Z _EGFR , был разработан в соответствии с аминокислотной последовательностью Z _EGFR : 1907 (обозначенной в этой статье как Ze) ²⁶ . Дополнительную метку (HE) 3 и остаток Cys добавляли к N- и C-концам аффитела Ze соответственно. Ген был оптимизирован для экспрессии в E. coli и синтезирован компанией Convenience Biology (Чанчжоу, Китай). Экспрессионная плазмида pQE30-Ze была сконструирована путем вставки гена, кодирующего аффибоди Ze, в pQE30. Для получения аффибоди Ze, pQE30-Ze трансформировали в E. coli M15 и индуцировали добавлением изопропил-β-D-тиогалактозида (IPTG, 0.1 мМ) при 24 ° C в течение ночи. После сбора клеток центрифугированием при 7000 g в течение 10 мин их ресуспендировали в связывающем буфере (50 мМ фосфат, pH 8,0; 300 мМ NaCl; 5 мМ имидазол, 1 мМ фенилметилсульфонилфторид) с последующим пропусканием через гомогенизатор высокого давления. (50-80 МПа) 3-4 раза. Аффитела Ze в супернатанте были связаны со смолой Ni-NTA super flow (Qiagen, CA) и элюировались с использованием элюирующего буфера (50 мМ фосфат, pH 8,0; 300 мМ NaCl, 300 мМ имидазол). Очищенные аффитела Ze подвергали диализу против фосфатно-солевого буфера (PBS, 10 мМ Na ₂ HPO ₄ , 2 мМ KH ₂ PO ₄ , 137 мМ NaCl, 2. 68 мМ KCl, pH 7,4) в течение ночи с последующим хранением при -70 ° C до дальнейшего использования.

Электрофорез в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (SDS-PAGE) и эксклюзионная хроматография (SEC) были использованы для определения чистоты и молекулярной массы Ze affibody ²⁹ . Для измерения аффинности аффинного тела Ze к EGFR внеклеточный домен EGFR, слитый с Fc IgG1 (Sino Biological, Пекин, Китай), иммобилизовали на покрытых протеином А зондах с последующей вставкой зонда в растворы, содержащие различные концентрации. Зе affibody.Последующую интерферометрию биослоя проводили на платформе Octet® (Pall ForteBio LLC, CA), как описано Yang et al. ²⁸ .

Получение и характеристика белков TRAIL

IgBD-TRAIL и TRAIL были получены и охарактеризованы в соответствии с нашими предыдущими работами ²⁸ . IgBD-TRAIL продуцировали путем генетического слияния IgG-связывающего домена (IgBD) с N-концом TRAIL. Чтобы исследовать связывание IgG с помощью SEC, IgBD-TRAIL смешивали с мышиным IgG (mIgG) в молярном соотношении 1: 1 с последующей инкубацией при комнатной температуре в течение 0. За 5 ч до загрузки в колонку для SEC. Образование нового белкового комплекса большего размера, чем отдельные mIgG и IgBD-TRAIL в смеси, отражает связывание IgBD-TRAIL с mIgG. Разница в периоде полужизни в сыворотке между IgBD-TRAIL и TRAIL была проиллюстрирована путем измерения зависящего от времени снижения цитотоксичности остаточных белков TRAIL в крови. Снижение скорости цитотоксичности отражает скорость выведения этих белков TRAIL из крови.

Поглощение опухолью и тканевое распределение белка

Для маркировки белка 5 (6) -карбоксифлуоресцеин (FAM) или CF ^TM 750 сукцинимидиловый эфир (CF750) (Sigma, MA) конъюгировали с белками Ze affibody или TRAIL. согласно методам, описанным Shi et al. ²⁹ . Вкратце, pH раствора, содержащего 1,5 мг / мл белка, сначала доводили до 8,0 добавлением 1 М NaHCO ₃ . Затем флуоресцентный краситель, растворенный в диметилсульфоксиде (ДМСО), добавляли к раствору белка в надлежащем молярном соотношении (белок 1:20 к FAM; белок 1: 6 к CF750) с последующей инкубацией при комнатной температуре в течение 1 часа в темноте. Свободный краситель исключили диализом смеси против PBS в течение ночи с многократной заменой буфера.

Для определения распределения в тканях с помощью оптической визуализации белки, меченные CF750 (3 мг / кг для Ze и 5 мг / кг для белков TRAIL), внутривенно вводили мышам, несущим подкожные трансплантаты опухоли. Опухоли и некоторые важные органы / ткани были собраны и сканированы с использованием оптической системы визуализации IVIS (Caliper Life Sciences, Калифорния) через 4 часа. Для дальнейшего изучения клеточного распределения Ze affibody мышам внутривенно вводили FAM-меченное Ze affibody. Опухолевые трансплантаты собирали и разрезали в замороженных условиях через 4 часа после инъекции.Опухолевые клетки указывали с помощью иммунофлуоресценции с кроличьими антителами против EGFR человека перед наблюдением под флуоресцентным микроскопом. Совместная локализация FAM-меченного аффибоди Ze с EGFR выявляет распределение аффибоди Ze на опухолевых клетках.

Чтобы исследовать влияние ФДТ на поглощение белков TRAIL опухолью, мышам, несущим опухолевые трансплантаты, внутривенно вводили равные молекулярные количества FAM-меченых IgBD-TRAIL или TRAIL с последующей ФДТ. Через час трансплантаты опухоли собирали и делали срезы в замороженных условиях.Клетки в опухолевых тканях визуализировали окрашиванием DAPI перед наблюдением под многофотонным лазерным конфокальным микроскопом (Nikon, Токио, Япония). Сравнивали поглощение белков опухолевыми трансплантатами, обработанными с ФДТ или без нее.

Конъюгирование фотосенсибилизатора с Ze affibody

Фотосенсибилизатор IRDye ^® 700DX сложный эфир N-гидроксисукцинимида (IR700, LI-COR Biosciences, Lincoln, NE) был конъюгирован с Ze affibody согласно описанному методу Ze-IR700. Автор: Mitsunaga et al. ²⁴ с некоторыми модификациями. Вкратце, Ze affibody разбавляли PBS до 1,5 мг / мл с последующим доведением pH раствора белка до 8,5 добавлением 1 M Na ₂ HPO _3. Затем растворимый IR700 смешивали с белком. при молярном соотношении 1: 2 (белок к IR700) и инкубировали при комнатной температуре в течение 1 ч в темноте. Для удаления неконъюгированного красителя IR700 смесь диализовали против PBS в течение ночи с многократной заменой буфера. Для подтверждения конъюгации IR700 с аффителом Ze диализованную смесь подвергали электрофорезу на геле SDS-PAGE и сканировали с помощью двухцветной инфракрасной системы визуализации LI-COR Odyssey CLx Imager (Lincoln, NE).

Клеточная культура и анализ цитотоксичности

CRC, включая COLO205, COLO 320 DR, COLO 320 HSR, LS174T, HT29, HCT-8, LOVO, RKO, LS180, T84 и HCT116, были приобретены у американской типовой культуры. Сбор (ATCC, VA, USA) и культивирование в соответствии с руководством, предоставленным поставщиком. Генотипирование этих клеток с помощью коротких тандемных повторов (STR) было выполнено Feiouer Inc. (Чэнду, Китай).

Для измерения цитотоксичности белков TRAIL в клетках CRC, предварительно обработанных Ze-IR700-опосредованной PDT, клетки CRC (1-2 × 10 ⁴ клеток / лунка) высевали в 96-луночный планшет с прозрачным дном и черным дном (Thermo, CA ) инкубировали с 0.5-2 мкМ Ze-IR700 при 37 ° C в течение 0,5 ч перед облучением. После PDT к клеткам добавляли возрастающие концентрации IgBD-TRAIL или TRAIL с последующей инкубацией в течение ночи. Выжившие клетки измеряли с использованием раствора CCK-8 (Dojindo, Япония) в соответствии с описаниями Yang et al. ²⁸ . По сравнению с цитотоксичностью белков TRAIL в клетках CRC без обработки PDT, увеличение цитотоксичности TRAIL в клетках CRC, обработанных PDT, отражает синергию между белками TRAIL и опосредованной Ze-IR700 PDT.Для определения зависимости синергизма от рецептора смерти растворимый рецептор смерти, включая DR4-Fc и DR5-Fc (Sino Biological Inc, Пекин, Китай), добавляли в клетки, обработанные PDT, перед добавлением белков TRAIL.

Для исследования цитотоксичности химических препаратов клетки CRC обрабатывали цисплатином, винкристином, доксорубицином или бортезомибом (Селлек, Техас) в различных концентрациях (0–5000 нМ) в течение ночи с последующим измерением выживших клеток с помощью CCK8.

Для расчета выживаемости жизнеспособность обработанных PBS клеток считалась 100%.

Ze-IR700-опосредованная PDT в клетках CRC выполнялась согласно описанию Shi et al. ²⁹ с небольшими изменениями. Вкратце, клетки (1 × 10 ⁴ клеток / лунку) высевали в 96-луночный планшет с прозрачным дном и черным дном и инкубировали в течение ночи. Ze-IR700 (4 мкМ) добавляли в клетки и дополнительно инкубировали в течение 0,5 ч при 37 ° C. После двух промывок DMEM с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) клетки облучали лазером с плотностью потока энергии 16 мВт / см ² для получения общей дозы 10 Дж / см ² при 690 нм .Выжившие клетки измеряли на следующий день с помощью CCK-8. Для визуализации живых и мертвых клеток приблизительно 2 × 10 ⁴ клеток инокулировали в 96-луночный планшет и обрабатывали PDT. SYTO 9 (указывает на живые клетки) и йодид пропидия (PI, указывает на мертвые клетки) добавляли к клеткам в соответствии с инструкциями набора Live / Dead BacLight Bacterial Viability Kit (Invitrogen, CA) через 1 час после PDT. Чтобы проверить роль Ze в качестве носителя для IR700, аффибоди Ze в Ze-IR700 было разрушено расщеплением Ze-IR700 трипсином. Ze-IR700, расщепленный трипсином (Ze-IR700-TN), использовали в качестве контроля в некоторых экспериментах.

Чтобы определить органеллу-мишень для Ze-IR700-опосредованной PDT в клетках CRC, накопление Ze-IR700 в митохондриях и лизосомах наблюдали под многофотонным лазерным конфокальным микроскопом. Клетки (2 × 10 ⁵ клеток в 300 мкл среды) инкубировали со смесью Ze-IR700 (5 мкМ), трекера органелл (MitoTracker для митохондрий, LysoTracker для лизосом; 200 нМ; Thermo, MA) и Hoechst ( указывающие ядра) при 37 ° C для 0.5 ч. Для определения участия АФК в Ze-IR700-опосредованной ФДТ для обнаружения АФК в облученных клетках использовали диацетат дихлородигидрофлуоресцеина (DCFH, Beyotime, Шанхай, Китай) и датчик синглетного кислорода (SOSG, Invitrogen, Карлсбад, Калифорния) описания Shi et al. ²⁹ . Ze-IR700, расщепленный трипсином (Ze-IR700-TN), использовали в качестве контроля для Ze-IR700.

Для определения экспрессии DR4 и DR5 в клетках CRC методом проточной цитометрии 4 × 10 ^{5 клеток} (в 100 мкл среды) инкубировали с 10 мкМ (для LS174T) или 5 мкМ (для HT29) Ze-IR700 в пробирка Эппендорфа при 37 ° C для 0. 5 ч. После двух промывок PBS клетки переносили в 48-луночный планшет и облучали при 690 нм до общей дозы 10 Дж / см ² . Затем эти клетки инкубировали с первичными антителами против DR4 или DR5 в течение 1 часа с последующей инкубацией с соответствующими вторичными антителами в течение 0,5 часа перед анализом проточной цитометрии. Клетки, обработанные без ФДТ, использовали в качестве контроля.

Для исследования влияния ФДТ, опосредованного Ze-IR700, на экспрессию генов клеток CRC путем секвенирования РНК, 5 × 10 ^{5 клеток} инкубировали с 1 мкМ Ze-IR700 в пробирке Эппендорфа, содержащей 500 мкл среды при 37 ° С. ° C для 0.5 ч. После двух промывок PBS клетки переносили в 48-луночный планшет для облучения (690 нм, 10 Дж / см ² ). Эти клетки собирали через 1 или 24 часа после облучения для экстракции общей РНК с использованием TRIzol regent в соответствии с руководством. Секвенирование РНК было выполнено Beijing Genomics Institution (Шэньчжэнь, Китай). Клетки, не подвергнутые обработке PDT, использовали в качестве контроля.

Проточная цитометрия и иммунофлуоресценция

Уровни экспрессии EGFR, DR4, DR5, CD31 и индуцируемого гипоксией фактора-1α (HIF1α), расщепленной каспазы 3, расщепленного PARP и Ki67 исследовали с помощью проточной цитометрии или иммунофлуоресценции с первичными антителами и соответствующие им вторичные антитела.Первичные антитела включают кроличьи антитела против EGFR человека, DR4, DR5, HIF1α (Abcam, MN), Ki67 (Invitrogen, CA), расщепленную PARP или расщепленную каспазу 3 (ZEN Bioscience, Chengdu, Китай) и крысиные антитела против CD31 мыши. (БиоЛедженд, Калифорния). Вторичные антитела, полученные от ослов или коз, были помечены DyLight 550 или DyLight 488 (Abcam, MN). Первичные антитела инкубировали с опухолевыми клетками или опухолевыми тканями при комнатной температуре в течение 1,5 часов перед инкубацией со вторичным антителом в течение дополнительных 0,5 часа.

Для определения связывания белка 3 × 10 ⁵ клеток инкубировали с 200 нМ FAM- или 4 мкМ IR700-меченным Ze affibody при 4 ° C в течение 1 ч перед анализом на проточном цитометре (Cytomics FC500, Beckman , Калифорния). Все данные были проанализированы с помощью программного обеспечения FLOWJO.

Вестерн-блоттинг

Для измерения регуляции рецепторов смерти (DR4 и DR5) и рецепторов-ловушек (DcR1 и DcR2) с помощью PDT, 4 × 10 ⁵ клеток LS174T инкубировали с Ze-IR700 (2 мкМ) при 37 °. C для 0.5 ч с последующим облучением. Чтобы изучить подавление рецепторов смерти с помощью миРНК, 6 × 10 ⁴ клеток HCT116 инкубировали с 75 нМ миРНК, специфичной для DR4 (siDR4, 5′-CCACAAAGAAUCAGGCAAU-3 ‘) или DR5 (siDR5, 5′-CAGCCGUAGGUCUUGA ) в течение 48 ч в 24-луночном планшете. Нерелевантную миРНК (siNC, 5’-UUCUCCGAACGUGUCACGU-3 ‘) использовали в качестве отрицательного контроля. Мембранные белки клеток экстрагировали с использованием буфера для лизиса RIPA (Beyotime, Шанхай, Китай) для SDS-PAGE. Вестерн-блоттинг выполняли с кроличьими антителами против DR4, DR5, DcR1 (Abcam, MN), расщепленным PARP, расщепленной каспазой-3, каспазой-9 (ZEN Bioscience, Чэнду, Китай) и мышиными антителами против человеческого белка, расщепленными каспазой-8. (Технология сотовой сигнализации, Массачусетс).Для устранения ROS перед ФДТ в клетки добавляли 4 мМ антиоксиданта ацетилцистеина (NAC) (Selleck Chemicals, TX).

Животная модель трансплантата опухоли и лечение

Были соблюдены все применимые институциональные руководящие принципы по уходу и использованию животных. Клетки CRC (2 × 10 ⁶ клеток для COLO 205 и LS174T, 5 × 10 ^{6 клеток} для HT29, в 100 мкл PBS) вводили подкожно в правые задние лапы самки BALB в возрасте от 4 до 6 недель. / c голые мыши. Измеряли продольный (L) и поперечный (W) диаметры опухолевых трансплантатов и рассчитывали объем опухоли (V) по формуле: V = L × W × W / 2.Мышей, несущих опухолевые трансплантаты, лечили белками TRAIL или опосредованной Ze-IR700 PDT в качестве монотерапии или комбинированной терапии. После лечения объем опухоли измеряли каждый день. Когда объем опухоли достигал 1000 мм ³ , мышей умерщвляли. В некоторых экспериментах для мониторинга роста опухоли с помощью оптической визуализации модели животных с трансплантатом опухоли конструировали путем подкожной инъекции клеток CRC, экспрессирующих красный флуоресцентный белок (RFP) (производства Ji Manchu Biotechnology, Шанхай, Китай).

Для оценки противоопухолевого эффекта белков TRAIL в качестве монотерапии мышам, несущим опухолевые трансплантаты, внутривенно вводили однократную дозу IgBD-TRAIL (3 мг / кг для COLO 205, 10 мг / кг для LS174T и HT 29) или TRAIL. (10 мг / кг). PBS использовали в качестве контроля.

Для оценки противоопухолевого эффекта Ze-IR700-опосредованной PDT в качестве монотерапии мышам, несущим опухолевые трансплантаты, внутривенно вводили Ze-IR700 (1 или 3 мг / кг). Облучение (интенсивность потока 100 мВт / см ² для общей дозы 60 Дж / см ² ) проводили через 4 часа после инъекции Ze-IR700.Мышам контрольной группы вводили такой же объем PBS. Чтобы изучить повреждение ткани, опосредованное PDT, трансплантаты опухоли собирали в разное время после PDT, и гистологию опухолевых тканей исследовали с помощью окрашивания H&E.

Для оценки противоопухолевого эффекта комбинированной терапии белками TRAIL и ФДТ, опосредованной Ze-IR700, мышам внутривенно вводили 1 мг / кг Ze-IR700. IgBD-TRAIL или TRAIL (3 мг / кг) вводили внутривенно мышам непосредственно перед облучением (скорость потока 100 мВт / см ² для общей дозы 60 Дж / см ² ) мышей.Одновременно проводили монотерапию ФДТ, IgBD-TRAIL и TRAIL. Для сравнения способности этих методов лечения индуцировать апоптоз опухолевые трансплантаты собирали через 24 часа после обработки для обнаружения апоптотических клеток с использованием анализа мечения ник-концов dUTP терминальной дезоксинуклеотидилтрансферазы (TUNEL) (Promega, WI), иммунофлуоресценции с антителом против расщепленной каспазы 3 или расщепленного PARP. . Пролиферативные клетки в трансплантатах опухоли проиллюстрировали с использованием Ki67 в качестве индикатора. Одновременно повреждение тканей в этих опухолевых трансплантатах и ​​нормальных тканях (печени и почках) было проиллюстрировано окрашиванием H&E.

Статистический анализ

Односторонний дисперсионный анализ (ANOVA) для множественных сравнений был выполнен с использованием программного обеспечения SPSS версии 17.0. Результаты выражены как среднее значение ± стандартная ошибка (SEM), а уровень значимости был определен как p < 0,05.

Результаты

Монотерапия TRAIL длительного действия уничтожает большие опухолевые трансплантаты клеток CRC с химиотерапевтическим МЛУ, но не клеток CRC с химиотерапевтическим МЛУ и резистентностью к TRAIL.

TRAIL длительного действия, i.е. , IgBD-TRAIL, был сконструирован путем слияния IgG-связывающего домена (IgBD) с N-концом TRAIL, что позволило IgBD-TRAIL связывать IgG (фигура A). Согласно нашим предыдущим работам ²⁸ , поскольку IgG демонстрирует длительную циркуляцию в крови, период полужизни IgG-связывающего IgBD-TRAIL в сыворотке был увеличен в 50-60 раз, чем у TRAIL, что демонстрирует больший противоопухолевый эффект. Здесь, перед оценкой синергизма между IgBD-TRAIL и PDT, мы проверили способность связывания IgG и длительную циркуляцию IgBD-TRAIL.После инкубации IgBD-TRAIL с mIgG анализ SEC продемонстрировал новый пик белка с кажущейся молекулярной массой, которая определенно была выше, чем у отдельного mIgG (фигура A), что указывает на то, что IgBD-TRAIL может связывать IgG. Для сравнения клиренса крови образцы плазмы мышей, которым вводили однократную дозу IgBD-TRAIL или TRAIL, собирали в разные моменты времени для анализа цитотоксичности. Как показано на фиг. А, цитотоксичность образцов крови мышей, которым инъецировали TRAIL, не определялась через 2 часа после инъекции.Однако цитотоксичность образцов крови мышей, которым вводили IgBD-TRAIL, сохранялась по крайней мере 24 часа. Эти результаты показали, что IgBD-TRAIL может связывать эндогенный IgG, таким образом показывая значительно увеличенный период полужизни в сыворотке.

Противоопухолевый эффект белков TRAIL у мышей, несущих опухолевые трансплантаты клеток CRC. A. Характеристика белков TRAIL. IgBD-TRAIL продуцировали путем слияния IgG-связывающего домена (IgBD) с N-концом TRAIL. Связывание IgBD-TRAIL с mIgG анализировали с помощью SEC.Разница в клиренсе крови IgBD-TRAIL и TRAIL отражалась в зависимом от времени снижении гибели клеток, вызванном остаточными белками в плазме (разведенных в 25, 50 и 250 раз). B. Экспрессия DR4 и DR5. Указаны проценты клеток, положительных по рецептору смерти. C. Цитотоксичность белков TRAIL. D. Противоопухолевый эффект однократной дозы белков TRAIL, вводимой в день 0 мышам (N = 5-6), несущим опухолевые трансплантаты клеток COLO 205, LS174T или HT29.Трансплантаты опухоли COLO 205 обрабатывали 3 мг / кг IgBD-TRAIL (IgBD-TRAIL-3) или 10 мг / кг TRAIL (TRAIL-10). Мышей, несущих опухолевые трансплантаты LS174T или HT29, обрабатывали 10 мг / кг белков TRAIL.

Клетки CRC, включая COLO 205, COLO 320 DR, COLO 320 HSR, LS174T, HT29, HCT-8, HCT116, LOVO, RKO, T84 и LS180, устойчивы к нескольким химическим препаратам, таким как цисплатин, винкристин, доксорубицин. , и бортезомиб (рис. S1A), что указывает на то, что химиотерапевтический МЛУ распространен в клетках CRC. Из-за экспрессии рецепторов поверхностной смерти DR4 и DR5 (фигура B) TRAIL продемонстрировал цитотоксичность в этих клетках CRC, которая может преодолевать химиотерапевтическую MDR клеток CRC.Как показано на Фигуре C и Фигуре S1B, TRAIL проявлял сильную цитотоксичность в клетках COLO 205 и HCT116. Тем не менее, IC50 TRAIL в клетках LS174T и LS180 (30-40 нМ), HT29 и LOVO (200-300 нМ) и других клетках CRC (> 500 нМ) были намного выше, чем у TRAIL в клетках COLO 205 и HCT116 ( 0,2-0,5 нМ). Следовательно, в этой статье клетки COLO 205 и HCT116 с химиотерапевтическим МЛУ были определены как TRAIL-чувствительные клетки. Другие клетки CRC с химиотерапевтическим MDR были определены как TRAIL-устойчивые клетки.Хотя цитотоксичность in vitro TRAIL была аналогична цитотоксичности IgBD-TRAIL в клетках COLO 205 (Рисунок C), внутривенная инъекция одной низкой дозы (3 мг / кг) IgBD-TRAIL, но не высокой дозы ( 10 мг / кг) TRAIL ликвидировал большие (~ 300 мм ³ ) опухолевые трансплантаты клеток COLO 205 в течение 1 недели. Анализ поглощения опухолью показал, что IgBD-TRAIL с длительной циркуляцией накапливает больше, чем TRAIL в трансплантатах опухоли (фигура S2), способствуя большему противоопухолевому эффекту IgBD-TRAIL.Неожиданно, IgBD-TRAIL показал только слабое или умеренное подавление роста на трансплантатах опухоли HT29 и LS174T, что указывает на необходимость комбинировать IgBD-TRAIL с сенсибилизаторами для борьбы с этими клетками CRC с химиотерапевтической MDR и TRAIL-устойчивостью.

Монотерапия ФДТ, нацеленной на опухолевые клетки, эффективно индуцирует гибель клеток CRC с химиотерапевтической устойчивостью к МЛУ и TRAIL, но не может уничтожить их опухолевые трансплантаты

Для выполнения ФДТ, нацеленной на опухолевые клетки, использовали EGFR-специфический Z _EGFR (Ze) affibody в качестве носителя для фотосенсибилизатора IR700.Как показано на Фигуре A, аффибоди Ze, выделенного из E. coli , проявлялся в виде единственной полосы белка на геле SDS-PAGE и единственного пика белка на колонке SEC, что указывает на то, что аффитело Ze было очищено до гомогенности. Анализ белок-белкового взаимодействия показал, что аффинное тело Ze связывает EGFR с субнаномолярной аффинностью (KD = 0,43 ± 0,57 нМ, фигура B). Анализ проточной цитометрии продемонстрировал, что аффитело Ze может связывать EGFR-экспрессирующие клетки LS174T и HT29 (рис. C). Более того, внутривенно введенное аффибоди Ze преимущественно распределялось на EGFR-экспрессирующих клетках (фигура D, фигура S3A), таким образом накапливая в трансплантатах опухоли LS174T у мышей (фигура E).Напротив, аффитело Ze, расщепленное трипсином (Ze-TN), не обнаруживалось в трансплантатах опухоли (фигура S3B, C). Эти результаты продемонстрировали, что аффитело Ze может накапливаться в опухолевых трансплантатах клеток CRC, экспрессирующих EGFR, что указывает на потенциал аффибоди Ze в качестве носителя для фотосенсибилизатора.

Характеристики самонаведения опухоли Ze affibody с высоким сродством к EGFR. A. SDS-PAGE и SEC анализ очищенного аффибоди Ze. B. Связывание аффибоди Ze с EGFR анализировали с помощью интерферометрии биослоя. C. Экспрессия EGFR в клетках LS174T и HT29 и связывание аффибоди Ze с этими клетками. D. Клеточное распределение аффибоди Ze в трансплантатах опухоли LS174T. E. Распределение Ze affibody в тканях мышей, несущих опухолевые трансплантаты LS174T. Органы / ткани, полученные от мышей (N = 3), сканировали с помощью оптической системы визуализации IVIS через 4 часа после инъекции CF750-меченного аффибоди Ze.

Впоследствии фотосенсибилизатор IR700 был конъюгирован с аффителом Ze для получения Ze-IR700, нацеленного на EGFR (рис. A).Анализ проточной цитометрии продемонстрировал, что Ze-IR700 может связывать клетки LS174T и HT29 (рисунок B). После инкубации с клетками при 37 ° C в течение 0,5 ч Ze-IR700 мог проникать в клетки LS174T и преимущественно распределялся в лизосомах (Рисунок C), но не в митохондриях (Рисунок S4). Для определения гибели клеток, вызванной PDT, клетки CRC инкубировали с Ze-IR700 или трипсинизированным Ze-IR700 (Ze-IR700-TN) с последующими двумя промываниями средой перед облучением. Анализы DCFH и SOSG продемонстрировали, что Ze-IR700, но не опосредованная Ze-IR700-TN ФДТ, продуцировала высокие уровни ROS (Рисунок D).Соответственно, опосредованная Ze-IR700 ФДТ индуцировала более 90% гибели клеток в клетках LS174T и HT29. Напротив, одинаковое количество Ze-IR700-TN-опосредованной PDT показало небольшую цитотоксичность для обоих типов клеток (фигура E и фигура S5A). У мышей, несущих большие (~ 150 мм ³ ) опухолевые трансплантаты клеток LS174T или HT29, ФДТ оказывала зависимое от дозы подавление роста опухоли Ze-IR700. Как показано на Фигуре F, ФДТ, опосредованная 1 мг / кг Ze-IR700, показала очевидное подавление роста опухоли. Когда количество Ze-IR700 было увеличено с 1 мг / кг (Ze-IR700-1) до 3 мг / кг (Ze-IR700-3), подавление роста опухоли с помощью PDT еще больше усилилось.Однако как 1, так и 3 мг / кг Ze-IR700-опосредованная PDT не уничтожала каких-либо опухолевых трансплантатов у этих мышей. Эти результаты продемонстрировали, что монотерапия Ze-IR700-опосредованной PDT оказывала сильное подавление роста опухоли, но не уничтожала опухолевые трансплантаты этих клеток CRC с химиотерапевтической устойчивостью к MDR и TRAIL.

Противоопухолевый эффект Ze-IR700-опосредованной PDT у мышей, несущих опухолевые трансплантаты клеток CRC. A. Получение Ze-IR700 путем конъюгирования фотосенсора IR700 с Ze affibody. B. Связывание Ze-IR700 с клетками LS174T и HT29. C. Накопление Ze-IR700 в лизосомах клеток LS174T. D. АФК, продуцируемые в клетках LS174T, обработанных Ze-IR700- или трипсинизированным Ze-IR700 (Ze-IR700-TN) -опосредованной PDT. E. Гибель клеток LS174T и HT29, обработанных Ze-IR700- или Ze-IR700-TN-опосредованной PDT. F. Подавление роста опухоли посредством ФДТ, опосредованной Ze-IR700. Мышам (N = 5), несущим опухолевые трансплантаты LS174T или HT29, внутривенно вводили 1 мг / кг (Ze-IR700-1) или 3 мг / кг (Ze-IR700-3) Ze-IR700 с последующим облучением через 4 часа.

ФДТ, нацеленная на опухолевые клетки, сенсибилизирует клетки CRC к TRAIL путем активации рецепторов смерти и подавления рецепторов-ловушек

Анализ гибели клеток показал, что ФДТ, опосредованная Ze-IR700, индуцировала каспазозависимый апоптоз в клетках LS174T (рис. S5B, C). Анализ секвенирования РНК показал, что связанные с митохондриями проапоптотические белки, включая Bid, BAD, BAK1, BOK и BAX, подавлялись в клетках LS174T с помощью сублетальной PDT. Однако PDT индуцировала повышенную регуляцию проапоптотических белков, таких как каспазы (CSCP 2, 8), APAF1, DDIT3, катепсины (CTSC, CTSD), TP53, ATM и DFFA (рисунок A и таблица S1), что позволяет предположить, что PDT преимущественно индуцированный апоптоз, связанный с лизосомами.Помимо позитивной регуляции проапоптотических факторов, Ze-IR700-опосредованная PDT также увеличивала экспрессию антиапоптотических генов, таких как BCL2, BCL2L1, BIRC2 и BIRC6, XIAP, CFLAR, FAIM, HRAS и NRAS, семейство ELF (ELF1, 2 , 4), семейство PARP (PARP2, 4), PIK3CA, PIK3R1 и PIK3R3 (рисунок B и таблица S2), что указывает на возможность усиления противоопухолевого эффекта PDT за счет комбинации с другим индуктором апоптоза.

Ze-IR700-опосредованная PDT активировала рецепторы TRAIL и проявляла синергетическую цитотоксичность с белками TRAIL в клетках LS174T.А, Б, В. Профили экспрессии проапототических генов (A), антиапоптотических генов (B), рецепторов смерти и рецепторов-ловушек (C) в клетках LS174T, обработанных с ФДТ или без нее. D. Анализ проточной цитометрии DR4 и DR5 в клетках LS174T, обработанных с или без PDT. E . Цитотоксичность белков TRAIL в клетках LS174T, обработанных с ФДТ или без нее. F. Профиль экспрессии DR4 и DR5 в опухолевых тканях, обработанных с помощью или без PDT. Ткани опухоли, собранные перед PDT (PDT-0) или через 2 часа после PDT (PDT-120), замораживали и окрашивали антителом против DR4 или DR5.Микрососуды опухоли проиллюстрировали окрашиванием CD31. Ядра визуализировали окрашиванием DAPI.

Примечательно, что анализ секвенирования РНК показал, что Ze-IR700-опосредованная PDT значительно ( p < 0,01) увеличивала экспрессию мембранных рецепторов TRAIL, включая рецептор смерти DR4 (TNFRSF10A) и DR5 (TNFRSF10B). Однако рецепторы-ловушки TRAIL, включая DcR1 (TNFRSF10C) и DcR2 (TNFRSF10D), были подавлены (фигура C и таблица S3), что свидетельствует об эффективном синергизме между PDT и TRAIL в индукции апоптоза клеток CRC.Анализ проточной цитометрии подтвердил активацию DR4 и DR5 в клетках LS174T после лечения PDT. Как показано на рисунке D, положительные показатели рецепторов смерти в LS174T, обработанном Ze-IR700-опосредованной ФДТ, составляли 83,9% (DR4) и 96,5% (DR5) по сравнению с 16,5% (DR4) и 27,4% (DR5) этого количества. в необработанных клетках LS174T. Дальнейший вестерн-блоттинг показал, что PDT-индуцированная активация DR4 и DR5 и подавление DcR1 в клетках LS174T. Добавление антиоксиданта NAC в клетки устраняет влияние PDT на экспрессию рецептора смерти и рецептора-ловушки в этих клетках (фиг. S6A), что указывает на то, что PDT активирует рецепторы TRAIL посредством ROS.Соответственно, чувствительность клеток LS174T к белкам TRAIL была резко увеличена с помощью ФДТ. IC50 IgBD-TRAIL и TRAIL в клетках LS174T, обработанных PDT, были более чем в 10-40 раз (приблизительно 1-3 нМ против 30-40 нМ) ниже, чем IC50 в клетках LS174T без обработки PDT (Рисунок E), демонстрируя синергизм между Белки PDT и TRAIL в уничтожении клеток CRC. Добавление растворимого DR4-Fc или DR5-Fc в клетки CRC, обработанные PDT, аннулировало синергию (фиг. S6B), указывая на то, что синергизм между PDT и белком TRAIL в уничтожении клеток CRC зависит от рецептора смерти.Более того, экспрессия DR4 и DR5 в опухолевых тканях определенно увеличивалась после лечения PDT (фиг. F), предполагая, что опосредованная Ze-IR700 PDT будет сенсибилизировать опухолевые клетки к белку TRAIL в условиях in vivo . Хотя клетки HT29 проявляли большую химиотерапевтическую MDR и TRAIL-резистентность, чем клетки LS174T, in vitro Ze-IR700-опосредованная PDT также активировала мембранный DR4 (с 13,6% до 29%) и DR5 (с 20,6% до 41,1%). в ячейках HT29 (рисунок S7A). Соответственно, IC50 белков TRAIL в клетках HT29, обработанных PDT, были примерно в 20-60 раз (5-10 нМ против 200-300 нМ) ниже, чем IC50 в клетках HT29 без обработки PDT (рисунок S7B), что указывает на то, что PDT также резко повышает сенсибилизацию. Клетки HT29 на белки TRAIL путем активации рецепторов смерти.Более того, предварительная обработка Ze-IR700-опосредованной PDT увеличивала цитотоксичность TRAIL в клетках COLO 320 DR, COLO 320 HSR, HCT-8, LOVO, RKO, LS180, T84 и HCT116 (рисунок S7C), что указывает на то, что опухолевые клетки нацелены на PDT сильно сенсибилизировал клетки CRC к TRAIL. Тот факт, что подавление DR4 или DR5 отменяет синергизм между PDT и TRAIL в уничтожении клеток HCT116, предполагает, что PDT сенсибилизирует другие клетки CRC к TRAIL за счет увеличения экспрессии рецепторов смерти (фиг. S8).

Комбинированная терапия IgBD-TRAIL и ФДТ, нацеленная на опухолевые клетки, эффективно уничтожает большие опухолевые трансплантаты клеток CRC с химиотерапевтическим MDR и резистентностью к TRAIL

Помимо сенсибилизации клеток CRC к TRAIL, Ze-IR700-опосредованный in vivo PDT также нарушили сосудистую систему опухолевых трансплантатов.Как показано на фиг. S9A, в трансплантатах опухоли LS174T, собранных через 2 часа (PDT-120) и 6 часов (PDT-360) после PDT, наблюдались многочисленные эритроциты и сгустки крови. Соответственно, экспрессия HIF1α в опухолевых тканях увеличивалась со временем после ФДТ (фиг. S9B), указывая на то, что ФДТ разрушала сосуды опухоли и вызывала кровотечение и тромбоз, что еще больше усиливало гипоксию в трансплантатах опухоли. Из-за разрушения сосудов опухоли захват белков TRAIL опухолевыми трансплантатами LS174T был значительно увеличен (Рисунок A).Примечательно, что поглощение опухолью длительного действия IgBD-TRAIL было больше, чем поглощение TRAIL с коротким периодом полувыведения из сыворотки.

ФДТ, опосредованная Ze-IR700, увеличивала захват опухолью и индукцию апоптоза белков TRAIL в трансплантатах опухоли LS174T. А. Поглощение белков TRAIL опухолевыми трансплантатами, обработанными с ФДТ или без нее. B. Индукция апоптоза белков TRAIL в трансплантатах опухоли, обработанных с помощью или без PDT. Ткани опухоли собирали через 24 часа после обработки, и апоптотические клетки визуализировали окрашиванием TUNEL.Ядра проиллюстрировали окрашиванием DAPI. Скорость апоптоза выражали как отношение TUNEL-положительных клеток (апоптотических клеток) к DAPI-положительным клеткам (общее количество клеток). C. Гистология опухолевых трансплантатов, обработанных монотерапией или комбинированной терапией белков TRAIL и PDT. Ткани опухоли собирали через 24 часа после обработки и окрашивали H&E.

Последующие анализы индукции апоптоза продемонстрировали, что комбинация белков TRAIL и опосредованной Ze-IR700 PDT индуцировала больший апоптоз в трансплантатах опухоли LS174T, чем монотерапия либо белками TRAIL, либо PDT.Как показано на Фигуре B, процент апоптотических клеток в трансплантатах опухоли LS174T, обработанных 1 мг / кг Ze-IR700-опосредованной PDT, составлял 6,1 ± 4,2%. Частота апоптоза в трансплантатах опухолей, обработанных монотерапией TRAIL и IgBD-TRAIL, составила 11,9 ± 4,4% и 34,7 ± 7,9% соответственно. Однако частота апоптотических клеток в трансплантатах опухолей, обработанных TRAIL / PDT и IgBD-TRAIL / PDT, составила 35,8 ± 19,3% и 86,5 ± 8,1% соответственно, что намного выше, чем при монотерапии. Соответственно, комбинированная терапия IgBD-TRAIL и PDT индуцировала большую активацию каспаз in vitro (фиг. S10A) и in vivo (фиг. S10B).Пролиферативных клеток в опухолевых трансплантатах, обработанных комбинированной терапией, было определенно меньше, чем в опухолевых трансплантатах, обработанных монотерапией (фигура S10B). Дальнейший гистохимический анализ показал, что монотерапия Ze-IR700-опосредованной PDT, TRAIL или IgBD-TRAIL только частично повреждает ткани опухоли. Хотя комбинированная терапия с использованием TRAIL и PDT сильно повредила опухолевые трансплантаты, многие опухолевые ткани все еще были видны на краях опухолевых трансплантатов. Однако комбинация IgBD-TRAIL и Ze-IR700-опосредованной PDT повреждает большинство опухолевых тканей в трансплантатах опухоли LS174T (фигура C).Эти результаты показали, что ФДТ, нацеленная на опухолевые клетки, усиливает in vivo -зависимую от каспазы индукцию апоптоза белков TRAIL.

Противоопухолевый эффект белков TRAIL в сочетании с Ze-IR700-опосредованной PDT или без нее был сначала оценен на мышах, несущих опухолевые трансплантаты (~ 150 мм ³ ) нативных клеток LS174T или клеток LS174T, экспрессирующих RFP. Как показано на рисунке А, оптические изображения продемонстрировали, что флуоресценция опухолевых трансплантатов увеличивается со временем после обработки белками TRAIL.После лечения с помощью Ze-IR700-опосредованной ФДТ и комбинированной терапии с помощью TRAIL и ФДТ флуоресценция в большинстве опухолевых трансплантатов снизилась в ранние сроки (2-3 дня) после лечения. Однако флуоресценция во всех опухолевых трансплантатах, обработанных комбинированной терапией IgBD-TRAIL и PDT, не определялась со второго дня после лечения. Кривые роста опухоли продемонстрировали, что монотерапия TRAIL не показала подавления опухоли по сравнению с контролем PBS. Монотерапия Ze-IR700-опосредованной PDT или IgBD-TRAIL показала умеренное подавление роста опухоли.Комбинированная терапия TRAIL и PDT вызвала отсутствие прогрессирования в течение одной недели после лечения. Однако очевидное кровотечение, сопровождающееся образованием струпа, наблюдалось во всех опухолевых трансплантатах, обработанных комбинированной терапией IgBD-TRAIL и PDT, начиная со второго дня после лечения. В последующие дни эти опухолевые трансплантаты непрерывно сокращались, за чем следовало поглощение или выделение из организма (Рисунок B). В конце этого наблюдения 70% (9 из 13) опухолевых трансплантатов были уничтожены (Рисунок B, C и Рисунок S11A).Эти результаты продемонстрировали, что Ze-IR700-опосредованные белки PDT и TRAIL проявляли синергетический противоопухолевый эффект. Однако комбинация IgBD-TRAIL длительного действия, но не TRAIL с коротким периодом полужизни в сыворотке, и PDT эффективно уничтожала трансплантаты опухоли LS174T.

Противоопухолевый эффект комбинированной терапии белков TRAIL и опосредованной Ze-IR700 ФДТ у мышей, несущих трансплантаты опухоли LS174T. A. Динамическая оптическая визуализация мышей, несущих опухолевые трансплантаты RFP-экспрессирующих клеток LS174T, обработанных белками TRAIL в комбинации с PDT или без нее. B. Типичные изображения мышей с трансплантатами опухоли до и после лечения комбинированной терапией IgBD-TRAIL и PDT. C. Кривые роста опухолевых трансплантатов после лечения монотерапией или комбинированной терапией протеинами TRAIL и PDT. Однократное лечение проводили в день 0. Указано количество мышей с эрадикацией опухоли (без опухоли).

Подобно таковому в опухолевых трансплантатах LS174T, Ze-IR700-опосредованная PDT также увеличивала поглощение TRAIL, как и IgBD-TRAIL опухолевыми трансплантатами HT29 (фигура A).По сравнению с TRAIL с коротким периодом полувыведения из сыворотки, IgBD-TRAIL длительного действия в сочетании с Ze-IR700-опосредованной PDT вызывал больший (72,6 ± 12,8% против 28,3 ± 8,7%) апоптоз в трансплантатах опухоли HT29 (рисунок B). Кривые роста опухоли продемонстрировали, что монотерапия Ze-IR700-опосредованной PDT или белков TRAIL показала небольшое подавление роста опухоли. Комбинированная терапия TRAIL и PDT только уменьшила рост опухоли в течение короткого периода (3-4 дня) после лечения. Однако комбинация IgBD-TRAIL и PDT резко повредила трансплантаты опухоли HT29, что вызвало обширное кровотечение и образование струпа после 2 ^-го или 3 ^{-го дня после лечения.В течение следующих дней у большинства мышей наблюдали абсорбцию или отслаивание трансплантата опухоли. В конце наблюдения 50% (6 из 12) опухолевых трансплантатов были уничтожены комбинированной терапией IgBD-TRAIL и PDT (Рисунок C, Рисунок S11B). Оптические изображения мышей, несущих опухолевые трансплантаты из RFP-экспрессирующих клеток HT29, подтвердили подавление роста опухоли, а также уничтожение опухолевых трансплантатов при комбинированной терапии белков TRAIL и PDT (Рисунок D, Рисунок S12). Эти результаты продемонстрировали, что комбинация TRAIL длительного действия, но не TRAIL, с коротким периодом полужизни в сыворотке также высокоэффективна против трансплантатов опухоли HT29.}

Противоопухолевый эффект комбинированной терапии белков TRAIL и опосредованной Ze-IR700 ФДТ у мышей, несущих опухолевые трансплантаты HT29. А. Поглощение белков TRAIL опухолевыми трансплантатами, обработанными с ФДТ или без нее. B. Индукция апоптоза с помощью монотерапии или комбинированной терапии белков TRAIL и PDT в трансплантатах опухоли. C. Кривые роста опухолевых трансплантатов, обработанных монотерапией или комбинированной терапией белков TRAIL и PDT. Указывается количество мышей с эрадикацией опухоли (без опухоли). D. Типичные оптические изображения мышей с трансплантатами опухоли во время лечения комбинированной терапией IgBD-TRAIL и PDT. Однократное лечение проводили в день 0.

Как показано на фиг. S13, монотерапия IgBD-TRAIL и TRAIL у мышей, несущих опухолевые трансплантаты, не показала очевидного снижения массы тела мышей. Тем не менее, TRAIL, особенно IgBD-TRAIL в сочетании с PDT, вызывал небольшое (~ 10%) снижение массы тела мышей, несущих трансплантаты опухоли LS174T, в течение первых 4 дней после лечения.Однако гистохимический анализ печени и почек, собранный у этих мышей в конце наблюдения (день 16), не показал явных отклонений в структуре. Снижение массы тела, опосредованное комбинированной терапией IgBD-TRAIL и ФДТ, составило менее 5%. Эти результаты позволяют предположить, что комбинированная терапия IgBD-TRAIL и PDT может вызвать легкое острое повреждение у мышей.

Обсуждение

Высокий уровень смертности, связанной с CRC, в основном объясняется МЛУ клеток CRC, конститутивно экспрессирующих переносчики ABC, в химиотерапевтические препараты первой линии ^{2 , 4} .Фактически, клетки CRC широко устойчивы к химическим препаратам, таким как цисплатин, винкристин, доксорубицин и бортезомиб (рис. S1A), что указывает на то, что химиотерапевтическая МЛУ распространена в клетках CRC. Поскольку большие белки с различными механизмами могут обходить пути устойчивости к небольшим химическим веществам, TRAIL, обладающий цитотоксичностью в отношении химически устойчивых раковых клеток, рассматривается как новый терапевтический вариант для лечения резистентных видов рака ³⁰ . В нашей предыдущей работе новый вариант TRAIL, i.е. , IgBD-TRAIL, был получен путем слияния IgG-связывающего домена с N-концом TRAIL ²⁸ . Благодаря IgBD-опосредованному связыванию с эндогенным IgG, IgBD-TRAIL показал более длительный период полужизни в сыворотке и, таким образом, проявил больший противоопухолевый эффект, чем нативный TRAIL. У мышей, несущих TRAIL-чувствительные клетки COLO 205, системное введение низких доз (3 мг / кг) IgBD-TRAIL уничтожило все большие (~ 300 мм ³ ) опухолевые трансплантаты (Рисунок D), что вызвало у нас интерес к исследованию потенциал IgBD-TRAIL в борьбе с CRC с большей МЛУ.Было обнаружено, что клетки LS174T и HT29 CRC были более устойчивы, чем клетки COLO 205, к цисплатину, винкристину, доксорубицину, бортезомибу (рисунок S1A) и TRAIL (рисунок C). Соответственно, внутривенная инъекция высокой дозы (10 мг / кг) IgBD-TRAIL показала только умеренное подавление роста опухоли у мышей, несущих опухолевые трансплантаты LS174T или HT29 (Рисунок D), что указывает на то, что монотерапия белков TRAIL обнадеживает, но неэффективна для борьбы с клетками CRC. с химиотерапевтической устойчивостью к МЛУ и TRAIL. Определенно, необходимо разработать комбинированные стратегии для преодоления химиотерапевтической MDR и TRAIL-устойчивости клеток CRC.

TRAIL индуцирует апоптоз путем связывания с рецепторами смерти на поверхности раковых клеток ³¹ , что предполагает возможность повышения цитотоксичности TRAIL за счет увеличения мембранного DR4 и / или DR5. Сообщалось, что ROS могут увеличивать экспрессию рецептора смерти в раковых клетках ¹⁷ , что предполагает синергизм между PDT, продуцирующим ROS ^{20 , 21} и TRAIL в уничтожении клеток CRC с химиотерапевтической устойчивостью к MDR и TRAIL.Фактически, мы обнаружили, что опосредованная Ze-IR700 PDT продуцирует ROS и, таким образом, индуцирует апоптоз клеток LS174T (Рисунок D и E, Рисунок S5). Дальнейший анализ секвенирования РНК продемонстрировал, что сублетальная доза Ze-IR700-опосредованной PDT преимущественно ( P < 0,01) индуцировала связанные с лизосомами проапоптотические факторы в клетках LS174T (рисунок A, таблица S1). Неожиданно оказалось, что ФДТ, опосредованная Ze-IR700, также увеличила ряд генов, направленных против апоптоза и связанных с пролиферацией клеток (фигура B, таблица S2), что позволяет предположить, что монотерапия PDT может проявлять ограниченный противоопухолевый эффект.Фактически, монотерапия Ze-IR700-опосредованной PDT приводила к подавлению роста опухоли, но не к уничтожению каких-либо опухолевых трансплантатов клеток LS174T и HT29 с химиотерапевтической устойчивостью к MDR и TRAIL (фигура F).

Подобно Ze-IR700-опосредованной PDT, TRAIL также индуцировал апоптоз клеток LS174T (фиг. S5B, C), предполагая перекрестные помехи между PDT и TRAIL-опосредованными путями гибели клеток. Интересно, что ФДТ, опосредованная Ze-IR700, значительно усиливала экспрессию рецепторов смерти для TRAIL (DR4 и DR5) как в клетках LS174T (Рисунок C, 4D, Рисунок S6A, Таблица S3), так и в клетках HT29 (Рисунок S7A), тогда как рецепторы-ловушки TRAIL (DcR1 и DcR2) в клетках LS174T подавлялась PDT (фигура C, фигура S6A, таблица S3).Эти результаты предполагают синергизм между TRAIL и PDT в уничтожении клеток CRC. Фактически, чувствительность клеток LS174T и HT29 была увеличена в 10-60 раз с помощью PDT (Рисунок E, Рисунок S7B). Кроме того, опосредованная Ze-IR700 PDT также сенсибилизировала другие клетки CRC, такие как клетки COLO 320DM, COLO 320HSR, LOVO, T84, HCT-8, RKO, LS180 и HCT116, к TRAIL (рисунок S7C). Поскольку эти клетки CRC также устойчивы к химическим веществам (цисплатин, винкристин, доксорубицин и бортезомиб) и белкам TRAIL (TRAIL и IgBD-TRAIL) (рисунок S1), обширная сенсибилизация этих клеток к белкам TRAIL с помощью PDT предполагает потенциал комбинированной терапии. белков TRAIL и ФДТ, нацеленной на опухолевые клетки, в борьбе с рефрактерным CRC.

Согласно нашим результатам, период полужизни белков TRAIL в сыворотке тесно связан с синергическим противоопухолевым действием этих белков и PDT. С одной стороны, белок TRAIL с более длительным периодом полужизни в сыворотке может получить больше шансов на связывание и уничтожение опухолевых клеток, сенсибилизированных ФДТ. Как показано в Таблице S3, и DR4, и DR5 лишь незначительно индуцировались в течение 1 часа после PDT, тогда как их экспрессия увеличивалась примерно в два раза через 24 часа после PDT, что указывает на то, что индукция рецепторов TRAIL требует много времени.Однако TRAIL с коротким периодом полувыведения из сыворотки был исключен из крови в течение 0,5 часа после инъекции, тогда как цитотоксичность того же количества IgBD-TRAIL сохранялась по крайней мере 24 часа (Рисунок A). Хотя ФДТ увеличивала цитотоксичность in vitro IgBD-TRAIL и TRAIL до аналогичной степени (фигура E, фигура S7B), комбинация IgBD-TRAIL длительного действия и PDT вызывала больший апоптоз, чем TRAIL, с коротким периодом полужизни в сыворотке. в сочетании с PDT в трансплантатах опухоли (Рисунок B, Рисунок B).С другой стороны, помимо сенсибилизации клеток CRC, in vivo PDT обычно повреждает сосудистую систему опухолевых трансплантатов, что вызывает сверхусиленные эффекты проницаемости и удерживания, тем самым облегчая попадание лекарств в ложе опухоли ³² . Фактически, индуцированное PDT кровотечение, сопровождающееся увеличением поглощения опухолью белков TRAIL, наблюдалось как в трансплантатах опухоли LS174T, так и в HT29 (Рисунок A, Рисунок A). Однако поглощение опухолью длительного действия IgBD-TRAIL было намного больше, чем поглощение TRAIL с коротким периодом полувыведения из сыворотки.Следовательно, комбинация IgBD-TRAIL, но не TRAIL и PDT, эффективно уничтожала опухолевые трансплантаты клеток CRC с химиотерапевтической устойчивостью к MDR и TRAIL (фигура C, фигура C).

Для дальнейшей оценки вклада ФДТ в преодоление химиотерапевтической МЛУ клеток CRC мы сравнили уровни экспрессии транспортеров ABC в клетках LS174T, обработанных с ФДТ или без нее. Из переносчиков ABC, по крайней мере, подсемейства ABCB, ABCC и ABCG участвуют в МЛУ раковых клеток ³³ .Как показано на фиг. S14 и в таблице S4, в клетках LS174T, обработанных PDT, наблюдали как повышающую, так и понижающую регуляцию MDR-ассоциированных транспортеров ABC. Транспортеры ABC с повышенной регуляцией включали ABCB1 (p-гликопротеин, pGP), ABCB10, ABCC1-5 (белок 1-5, связанный с множественной лекарственной устойчивостью, MRP1-5) и ABCC9, 10 и 11. Транспортеры ABC с пониженной регуляцией включали ABCB4, ABCB6-9 , ABCC6 и ABCG2 (белок 1 устойчивости к раку молочной железы, BCRP1). В энтероцитах pGP, MRP1-5 и BCRP1 отвечают за отток химических препаратов ⁴ .За исключением BCRP1, Ze-IR700-опосредованная PDT увеличивала все остальные шесть переносчиков оттока в клетках LS174T (рисунок S14, таблица S4), что могло увеличивать химиотерапевтический MDR CRC. Эти результаты предполагают, что комбинация химических препаратов и ФДТ может иметь небольшой синергетический противоопухолевый эффект на CRC с MDR. Поскольку PDT индуцировал апоптоз клеток CRC (рисунок S5B), комбинация индукторов апоптоза на основе белков, включая TRAIL, лиганд Fas (Fas L) и фактор некроза опухоли α (TNFα), теоретически имеет больший потенциал для преодоления химиотерапевтического MDR CRC. .Фактически, PDT значительно увеличивал количество рецепторов смерти DR4 и DR5 для TRAIL, Fas для Fas L и TNFRSF1A для TNFα (Рисунок C и Таблица S3), обеспечивая молекулярную основу для синергизма между PDT и TRAIL, Fas L и TNFα в уничтожении CRC клетки. Однако из-за неэффективности растворимого Fas L в индукции апоптоза ³⁴ и систематической токсичности TNFα ³⁵ , эффективный TRAIL без ограниченной дозы токсичности должен быть лучшим выбором для комбинации с PDT в терапии рака.

Взятые вместе, наши результаты продемонстрировали, что Ze-IR700-опосредованная PDT резко повышала чувствительность клеток LS174T и HT29 к TRAIL-белкам за счет активации рецепторов смерти и что комбинация IgBD-TRAIL длительного действия и PDT эффективно уничтожала опухолевые трансплантаты обеих клеток CRC. . Поскольку Ze-IR700-опосредованная ФДТ сильно сенсибилизировала клетки CRC к белкам TRAIL (рис. S7C), наряду с развитием технологии лазерной доставки с помощью эндоскопа, ФДТ, нацеленная на опухолевые клетки в сочетании с TRAIL длительного действия, имеет большой потенциал для борьбы с неоперабельными первичными, так как а также метастатический CRC.Учитывая хорошую биобезопасность TRAIL и PDT у пациентов, важно провести клиническое воплощение этой комбинированной стратегии в прецизионной терапии CRC. Примечательно, что хотя комбинированная терапия IgBD-TRAIL и PDT вызвала временное снижение массы тела у мышей, несущих трансплантаты опухоли CRC (рис. S13), биобезопасность этой комбинированной стратегии должна быть дополнительно оценена в будущем. Помимо белков TRAIL, также интересно комбинировать PDT с другим форматом TRAIL, таким как TRAIL ³⁶ , опосредованный онколитическим вирусом, и TRAIL ^{37 , 38} , доставляемый стволовыми клетками, для терапии, направленной на CRC.

«Проблемы развития информационных систем в стране, готовящейся к f» Хосе Грикар, Франк Бракун и др.

Абстрактные

Несколько стран готовятся присоединиться к Европейскому Союзу в ближайшие несколько лет, и в ближайшие годы их число будет увеличиваться. Как информационные технологии могут поддержать эти усилия? В этой работе участвуют несколько заинтересованных сторон: правительство, бизнес, профессиональные ассоциации и образовательные учреждения. Как они могут помочь в использовании информационных технологий для поддержки процесса перехода и ускорения рыночной ориентации? Европейская интеграция является частью более широких процессов глобализации, которым способствуют информационные технологии.Как страны должны к этому готовиться? Глобальное подключение к Интернету открывает новые возможности для динамично развивающихся стран, готовящихся к электронной коммерции, электронному правительству и электронной демократии. Какую роль в этом играют профессиональные организации и университеты? Эксперт будет опираться на пример Словении, чтобы развить общие идеи совместной работы в процессе европейской интеграции с использованием информационных технологий для ускоренного развития. Поскольку коммерция переопределяется динамикой Интернета и других технологий электронной коммерции, участники дискуссии проанализируют нынешнюю ситуацию в Словении и обратятся к будущим изменениям.Они представят словенский пример универсальной торговли, в рамках которого будут представлены взаимно усиливающие изменения в деловой практике и базовых информационных технологиях. Универсальная коммерция — это обмен деловой информацией, поддержание деловых отношений и проведение деловых операций любыми способами (традиционными средствами и посредством телекоммуникационных сетей). В сегодняшней деловой среде, где операционные границы между фирмами стали плавными, непродуктивно отделять межорганизационные бизнес-процессы от внутриорганизационных.

Рекомендуемое цитирование

Грикар, Хосе; Бракун, Франк; Козель, Станко; Еловкан, Милан; Петрич, Дарджан; Силиконовый, Марин; и Зерко, Иван, «Проблемы развития информационных систем в стране, готовящейся к вступлению в Европейский Союз — Группа экспертов по Словении» (2001). ECIS 2001 Proceedings . 46.
https://aisel.aisnet.org/ecis2001/46

Темная красавица: Дуэт мамы и дочери Шерил и Келси Бэрд занимается конным бизнесом, но не просто четвероногим рысаком.Они заботятся о редкой породе, называемой фризской, — с гривой, как у рокеров 80-х, и телосложением, как у олимпийских спортсменов, — и объединяют этих конных подопечных со своими идеальными хозяевами.

Облако пыли поднимается, когда тяжелые копыта тревожат сухую местность. Черная, как обсидиан, лошадь делает свой круг на ринге — локомотив элегантной силы, по-видимому, не подозревая о своем весе почти в 1400 фунтов. Будь это пятнадцатый век, всадник, одетый во все черное, за исключением светлых волос, с таким же успехом мог бы быть рыцарем в кольчуге.Скорее, это просто еще один день на ферме Friesian Marketplace в Грире, Южная Каролина.

Келси Бэрд сидит на лошади по имени Ник, которую скоро отправят в его новый дом в Орегоне. Ник — как и его товарищи-фризы, Корнил, Кинг и Люк, если назвать некоторых, — всего лишь одна из лошадей, которых Келси, ее мать и деловой партнер Шерил импортировали из Голландии. За последние девять лет дуэт нашел идеальные дома для этих уникальных лошадей — от Австралии до Нэшвилла, Канады и Мексики, и да, даже чуть дальше по улице, где клиенту принадлежат шесть фризов.Это похоже на бизнес-историю, но с животными, особенно с лошадьми и их владельцами, все всегда гораздо более личным. Это то, что Шерил называет «сердечным делом», и они «сваты» — спаривают нужную лошадь с нужным владельцем.

Кто эти владельцы? Посмотрим, у Бэрдс были запросы от Марты Стюарт (ее агента), шейха из Дубая (его «парень») и участника группы Bon Jovi. (Из них пианист Бон Джови купил один для своей жены). Клиенты, которые пишут и зовут Бэрдс с пылкой благодарностью и сообщают новости о своей лошади через несколько лет после покупки, приходят отовсюду и из любого спектра.Менеджер кантри-шоу Big & Rich Марк Освальд и его жена Криста купили две лошади, одна из которых будет лошадью для гостей в особняке Фонтанел, бывшем доме кантри-звезды Барбары Мандрелл в Нэшвилле, который теперь принадлежит Освальдам. . Кроме того, есть оригинальный создатель продукта Simple Green, Джуди Уокер из Калифорнии, которая купила его для своей внучки Лорен, с которой Келси провела неделю на тренировках на Западном побережье.

Один из шести оригинальных фризов, купленных Бэрдами почти десять лет назад во время их первой поездки в Голландию, вызвал интерес у женщины по имени Блайт Браун из Нью-Гэмпшира.«Она рассказала мне о Зерко (зарегистрированное голландское имя лошади), — вспоминает Браун, — и после долгого разговора мы решили, что Зерко мне подойдет. Я полетел в Южную Каролину, чтобы встретить своего возможного нового компаньона на коне, и это была любовь с первого взгляда. Зерко приехал на нашу ферму в Нью-Гэмпшире, и тут же этот фризиец украл мое сердце. Я сменила его имя и дала сараю имя «Данте» — кончик шляпы для персонажа нового романа, который писал мой муж ».

Этот роман — Inferno Дэна Брауна, написанный через 10 лет после его блокбастера The DaVinci Code .У Данте, то есть лошади, теперь есть свой фан-клуб, и он украшает дверь сарая скульптурой на ферме Брауна, Исторический Раннимид, в Нью-Гэмпшире.

По своей природе величественные лошади обладают особенно сильной хваткой. Не ищите ничего, кроме Black Beauty, , написанного в 1877 году британской писательницей Анной Сьюэлл. Спустя более ста лет эта книга до сих пор остается одной из самых успешных из когда-либо изданных. И это про лошадь. Не фриз, заметьте, но все же лошадь. Но, как вам скажет любой фризский владелец, это не просто лошадь.

Отличительными чертами фризской породы, происходящей из Фрисландии на северо-западе Нидерландов, являются оперение на лапах, которое придает изящную деталь этим в остальном крупнокостным, широким колоссам, а также их длинные распущенные гривы и блестящие черные волосы. как полуночные пальто. Они нежны и уравновешены; конь знати — действительно, рыцарей в сияющих доспехах. Пока, как это было с тенденциями, фризы не превратились в упряжных лошадей для сельскохозяйственных целей, особенно во Фрисландии, где от этого зависела экономика.Фактически, лошадь почти полностью исчезла. «Они снова заставили породу развиваться, и они начали больше совершенствовать породу и делать ее более современной для спорта, — объясняет Шерил, которая начала заниматься верховой ездой в возрасте 6 лет и тренировала лошадей 35 лет, — и теперь они выглядят более спортивными, чем в других странах. старые времена, когда они были шире и толще для тяги ».

Конечно, как и в большинстве историй успеха, если бы не случайная встреча с Фриизаном, которого друг привел к Шерил на тренировку, это могла бы быть любая другая история про лошадей.Вместо этого «это была самая умная и опрятная лошадь, с которой я когда-либо работала, и я ничего о них не знала», — говорит Черил, сидя у камина в своем доме рядом с сараем. «Я сказал:« Я попробую ». Ему было три года, и поначалу он был немного сумасшедшим, поэтому я взял его, и оказалось, что я выиграл с ним пять титулов чемпиона мира».

«Однажды я вышел из сарая и сказал:« Однажды мы все будем черными. У нас будут все черные фризы ». И моя мечта сбылась. Вначале это было действительно тяжело, потому что мне пришлось ехать по менее путешествующей дороге, о которой я действительно мало что знал.Но мне потребовалось много времени, чтобы узнать о фризах, и мне это очень понравилось, так что это сделало это намного проще ».

Та самая лошадь по имени Маверик даже подходила, когда она кричала. У нее был свой момент в горячем месте с ним, когда Маверик должен был появиться в бейсбольном фильме Клинта Иствуда 2012 года, Проблемы с кривой . «Ему пришлось бежать по бейсбольному полю в Атланте, — говорит Шерил, — без недоуздка на полном скаку, и все киношники стояли прямо за мной, спрашивая:« Он это сделает? »Они отпустили его, и он кончил прямо к моим ногам, и все приветствовали.”

Если она звучит как гордая мама, так и есть. Хотя трудно сказать, гордится ли она больше своей дочерью (студентка Биоинженерии Клемсон, получившая стипендию, получившая степень магистра в 21 год), или успехом, которого они достигли вместе как динамичный дуэт, решивший начать онлайн-бизнес. бизнес по импорту лошадей из Голландии, которая в настоящее время является крупнейшим импортером Восточного побережья.

Шерил и Келси пытаются посетить Голландию три раза в год, и будут там в этом месяце. Они продают лошадей в количестве примерно трех штук в месяц, хотя в прошлом году они продали 50, что на сегодняшний день является самой большой суммой.Ник, лошадь, направляющаяся в Орегон, супермодель среди лошадей за его тренированность и красоту, является одной из самых продаваемых — 45000 долларов. Будь он моложе, он мог бы получить до 150 000 долларов. Деловой партнер Бэрдс из Голландии помогает им решить, какие лошади приезжают в Штаты — только лучшие, поскольку репутация Бэрдс блестящая, как угольно-черные мундиры их подопечных.

Лошади проделывают долгий путь из Амстердама в Нью-Йорк. «У каждой есть свой личный конюх, чтобы им было комфортно во время полета», — говорит Черил, затем добавляет, смеясь, «Ну, знаете, чтобы достать им коктейли или что-нибудь в этом роде.«Мерины остаются на карантине три дня, кобылы — две недели, а жеребцы — месяц. Оттуда мы отправимся в Орегон, Оклахому или Нью-Джерси (естественно, Бон Джови), путешествуя такими компаниями, как Horses2Fly, или в стойле, загруженном на большую грузовую платформу. Но это не раньше, чем их приветствуют, как нового члена семьи, на 10-акровой ферме Friesian Marketplace, удобно расположенной в десяти минутах от аэропорта.

«Обычно они приезжают в 2 или 3 часа ночи, и мы всегда в восторге», — говорит Шерил.«Каждый раз это как рождение ребенка. Они выходят из трейлера с ясными глазами, типа «Где мы? Это не Голландия! »Я угощаю их угощениями и устраиваю их поудобнее. Я сделаю им морковно-сладкий картофельный картофель, мы поцеловаем их и дадим им немного поспать, потому что они устали от поездки ».

Каждый студент колледжа, возвращающийся домой на весенние каникулы, должен быть таким удачливым. Но эти лошади и их отношения так много значат для этих двух женщин — в смысле того, что они значат для своих клиентов.Знаменитые и не очень известные люди находят дружбу, утешение и даже терапию в своем фризском языке, например, справляться с медленным уходом мужа от БАС, или с сокрушительным одиночеством после того, как они проходят, или добавляя большой всплеск черный к золотым годам, как один муж удивил свою жену. Темно-карие глаза Шерил сверкают, рассказывая историю. «Мы только что отправили лошадь в Вирджинию», — говорит она. «Этот человек приказал прийти всем церковным дамам по соседству, и его жена не знала.Подъехал трейлер, и он сказал: «У меня твоя новая лошадь!» »Как доброжелательный друг, устраивающий свидание вслепую, Шерил надеется, что это всегда будет идеальная пара. «Вы просто надеетесь, что все пойдет правильно», — говорит Шерил. «Для наших клиентов — и для наших лошадей. Важно, чтобы у них были нужные люди ».

Для Дебби Кеслинг из Огайо лошадь по имени Занзибар определенно была правильным выбором. Муж Кеслинг скончался от БАС, но не раньше, чем он получил лошадь своей мечты. «Он сказал одной женщине в сарае, что он рад, что у меня будет Занзибар, когда его больше не будет», — говорит Кеслинг.«Зан стала моей терапевтической лошадкой. Я могу сказать ему все, что угодно, и он не против слез, которые иногда идут вместе с этим ».

Бэрдс зарабатывают на жизнь своим любимым делом, воплощая в жизнь мечты людей, которые любят фризов так же сильно, как и они сами. Даже если это тяжелая работа семь дней в неделю. Мать Шерил, Кэролайн, которой за 70, даже помогает вести бухгалтерию и убирать прилавки. Постоянный уход, обслуживание и уход. У Бэрдов иного не было бы. «Вначале у вас есть действительно хорошая идея, но вы действительно не знаете, как она будет развиваться, пока не начнете делать это и не выясните, что работает, а что нет», — говорит Шерил.Но, как теперь знают Бэрдс, стремление к своей мечте — каким бы масштабным (в буквальном смысле) это мероприятие ни было — всегда будет выделять вас из породы.

есть вера — Польский перевод — Linguee